實(shí)時(shí)熒光定量PCR
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入可與DNA產(chǎn)物特異性結(jié)合的熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最終通過相對(duì)定量或絕對(duì)定量的方法確定各個(gè)樣本的本底表達(dá)量。qPCR檢測(cè)常用的兩種方法：染料法和TaqMan探針法。
相關(guān)實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)承諾函
咨詢記錄
技術(shù)文章
城市
時(shí)間
江蘇省南通市崇川區(qū)
2025-05-10 00:55:34
福建省廈門市
2025-05-09 20:55:14
浙江省紹興市
2025-05-09 20:01:39
浙江省麗水市
2025-05-09 16:27:41
江蘇省
2025-05-09 15:25:15
浙江省麗水市
2025-05-09 14:20:39
福建省廈門市
2025-05-09 13:33:49
江蘇省南通市崇川區(qū)
2025-05-09 12:54:24
江蘇省南通市崇川區(qū)
2025-05-09 07:02:27
湖北省
2025-05-09 05:14:41
基因表達(dá)調(diào)控基本特點(diǎn)
2024-07-19 14:50:50
ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線
2024-03-28 16:06:29
ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果分析
2024-03-28 13:44:05
ELISA原理、操作以及注意事項(xiàng)
2024-03-26 17:21:23
QPCR目的和意義
2024-01-15 17:36:24
核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)QPCR數(shù)據(jù)處理
2024-01-15 15:05:16
QPCR數(shù)據(jù)分析以及作圖方法
2024-01-11 14:23:33
QPCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)【QPCR實(shí)驗(yàn)外包】
2024-01-10 17:03:29
QPCR原理和主要的三個(gè)步驟
2024-01-09 17:37:18
QPCR原理以及數(shù)據(jù)處理
2024-01-05 14:09:57
QPCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)詳細(xì)的步驟與報(bào)告（三）
2024-01-05 13:07:01
QPCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)詳細(xì)的步驟與報(bào)告（二）
2024-01-04 17:05:09
QPCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)詳細(xì)的步驟與報(bào)告(一）
2024-01-04 13:48:46
QPCR檢測(cè)的是什么？
2024-01-03 17:34:53
WB檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告和詳細(xì)的操作步驟（下）
2023-12-21 14:42:54
WB檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告和詳細(xì)的操作步驟（中）
2023-12-21 13:36:16
WB檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告和詳細(xì)的操作步驟(上)
2023-12-20 16:36:30
什么是western blot？
2023-12-20 14:22:03
PCR設(shè)計(jì)引物的具體步驟【科研干貨】
2023-11-17 13:59:50
引物設(shè)計(jì)的依據(jù)【小白適用】
2023-11-16 14:40:06
qPCR引物設(shè)計(jì)流程【一文搞懂】
2023-11-16 13:11:45
如何巧妙設(shè)計(jì)引物？
2023-11-14 17:29:47
關(guān)于SNP檢測(cè)流程和應(yīng)用
2023-03-29 11:24:18
做酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定實(shí)驗(yàn)需要注意什么？
2023-03-27 16:28:08
實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qPCR）的介紹
2023-03-20 13:08:33
WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)介紹——檢測(cè)小鼠組織中GSTM2的表達(dá)
2023-03-17 14:12:46
WB實(shí)驗(yàn)原理及流程圖
2023-03-16 16:25:48
亞硫酸氫鈉測(cè)序（BSP）實(shí)驗(yàn)步驟【BSP外包】
2022-11-22 15:00:00
什么是亞硫酸氫鈉測(cè)序？【甲基化檢測(cè)外包】
2022-11-18 15:47:24
DNA染色法檢測(cè)支原體操作步驟【支原體檢測(cè)外包】
2022-11-04 10:39:27
培養(yǎng)法檢測(cè)支原體操作步驟【支原體檢測(cè)外包】
2022-11-04 10:22:06
PCR檢測(cè)支原體操作步驟【支原體檢測(cè)外包】
2022-11-03 17:25:02
支原體檢測(cè)方法大全【支原體檢測(cè)外包】
2022-11-02 17:03:33
什么是支原體檢測(cè)？【支原體檢測(cè)外包】
2022-10-27 17:48:46
SNP檢測(cè)常見問題答疑下篇
2022-08-09 19:14:35
SNP檢測(cè)常見問題答疑上篇
2022-08-09 11:24:24
直接測(cè)序法檢測(cè)SNP詳解——最常用的方法
2022-08-05 08:58:37
Taqman探針法檢測(cè)SNP分型詳解
2022-08-04 15:12:43
SNP檢測(cè)方法總結(jié)，有你用過的嗎？
2022-08-02 17:56:41
SNP/單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)最常用的三種方法
2022-08-02 15:23:47
什么是SNP/單核苷酸多態(tài)性？
2022-08-02 14:16:49
?實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)答疑
2022-07-28 13:55:45
實(shí)時(shí)熒光定量PCR常見問題及解決方法
2022-07-27 17:12:19
熒光定量PCR實(shí)操注意事項(xiàng)，注意避雷！
2022-07-27 11:49:18
熒光定量PCR結(jié)果分析解讀—熒光定量PCR外包
2022-07-26 11:17:27
熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)操作步驟，你做對(duì)了嗎？
2022-07-25 17:11:08
什么是實(shí)時(shí)熒光定量PCR？
2022-07-22 10:18:49
六種甲基化檢測(cè)方法【附視頻教程】
2022-05-16 17:09:40
DNA甲基化實(shí)驗(yàn)操作步驟
2022-05-13 11:52:54
?DNA甲基化實(shí)驗(yàn)介紹【科研小白】
2022-05-13 10:27:04
ELISA酶聯(lián)免疫吸附實(shí)操作常見問題處理方法【干貨滿滿】
2022-04-08 16:34:54
ELISA酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)操作常見問題答疑【附視頻教程】
2022-04-07 17:30:33
ELISA酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)【附視頻教程】
2022-04-07 16:07:13
ELISA酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)詳細(xì)操作步驟【附視頻教程】
2022-04-07 13:27:43
科研小白看的ELISA酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介與原理【附視頻教程】
2022-04-06 16:01:15
高分文章都怎么研究m6A甲基化
2022-01-10 14:50:24
DNA甲基化提高癌細(xì)胞對(duì)EGFR抑制劑敏感性的原因
2021-10-27 00:29:41
高分文章研究RNA甲基化詳細(xì)步驟
2021-10-26 17:19:51
m6A甲基化研究思路設(shè)計(jì)方法
2021-10-26 15:44:54
Nature子刊 | DNA甲基化 甲基轉(zhuǎn)移酶異位靶向擬南芥中CG
2021-05-27 17:59:59
實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)步驟和注意事項(xiàng)【附視頻教程】
2021-04-26 21:06:57
甲基化檢測(cè)的幾種方法和實(shí)驗(yàn)流程【附視頻教程】
2021-04-23 11:19:00
細(xì)胞因子檢測(cè)方法怎么選？常用檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)整理
2021-04-12 15:25:26
這是我見過的WB結(jié)果圖最多的文章！【文獻(xiàn)解讀】
2020-12-17 15:53:24
如何搞定Western Blot中的“奇葩”條帶【干貨文章】
2020-12-11 15:32:22
免疫沉淀及Pulldown這些方法原理你了解多少【新手入門】
2020-12-11 15:01:28
WB實(shí)驗(yàn)技術(shù)介紹【新手入門】
2020-12-11 14:59:38
實(shí)驗(yàn)介紹
【應(yīng)用簡(jiǎn)介】
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入可與DNA產(chǎn)物特異性結(jié)合的熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最終通過相對(duì)定量或絕對(duì)定量的方法確定各個(gè)樣本的本底表達(dá)量。qPCR檢測(cè)常用的兩種方法：染料法和TaqMan探針法。
【技術(shù)原理】
TaqMan探針法核心是探針分子，TaqMan探針是單鏈DNA，5’端偶聯(lián)發(fā)光基團(tuán)，3’端偶聯(lián)淬滅基團(tuán)，游離的完整探針是檢測(cè)不到熒光信號(hào)的，發(fā)光基團(tuán)發(fā)出的熒光會(huì)被淬滅基團(tuán)吸收淬滅，探針被水解，發(fā)光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)遠(yuǎn)離就可以檢測(cè)到熒光信號(hào)。反應(yīng)開始時(shí)，模板鏈經(jīng)熱變性解鏈形成單鏈，TaqMan探針優(yōu)先跟模板鏈退火，引物隨后退火到模板上，之后進(jìn)行鏈的延伸，延伸過程中Taq酶發(fā)揮5’-3’外切酶活性，遇到探針會(huì)從5’端逐個(gè)堿基切除探針，發(fā)光基團(tuán)會(huì)跟淬滅基團(tuán)分開，因此熒光檢測(cè)系統(tǒng)可以接收到熒光信號(hào)，每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，熒光信號(hào)的累積和PCR產(chǎn)物形成是同步的。
TaqMan探針法的特異性除了由引物提供，更由探針分子保證，因其退火溫度更高，所以TaqMan探針法特異性更好，在一個(gè)反應(yīng)體系中加入多條探針，可以做多個(gè)基因同時(shí)檢測(cè)。
【實(shí)驗(yàn)流程】
案例展示
結(jié)果分析：NTC組正常，表明QPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信，組間差異較小，操作合格。
常見問題
一、引物設(shè)計(jì)
1、序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段；
2、Taqman探針技術(shù)要求片段長(zhǎng)度在50bp-150bp；
3、避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)。避免引物自身或與引物之間形成4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)配對(duì)；
4、典型的引物18到24個(gè)核苷長(zhǎng)。引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長(zhǎng)度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性，較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。Tm值在55-65℃，GC含量在40%-60%；
5、引物之間的Tm值相差避免超過2°C；
6、引物的3’端避免出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上連續(xù)相同的堿基；
7、為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個(gè)外顯子；
8、探針位置盡可能地靠近上游引物；
9、探針的5'端應(yīng)避免使用堿基G，引物的3’端避免使用堿基A。探針長(zhǎng)度通常在25~35bp，Tm值在65~70°C ,通常比引物Tm高5 ~10°C，GC含量在40%~ 70%；
10、整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量；
11、為確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計(jì)好的序列在Blast中核實(shí)一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補(bǔ)區(qū)，建議重新設(shè)計(jì)引物探針。
二、熱啟動(dòng)
熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。
三、鎂離子濃度
鎂離子影響PCR的多個(gè)方面，如：對(duì)DNA聚合酶的活性的影響進(jìn)而影響產(chǎn)量;對(duì)引物退火的影響，進(jìn)而影響特異性。若dNTP和模板同鎂離子結(jié)合，則降低了酶活性所需要的游離鎮(zhèn)離子的量。
四、模板質(zhì)量
模板的質(zhì)量會(huì)影響產(chǎn)量。DNA樣品中可能有多種污染物會(huì)抑制PCR。
五、防止殘余污染
1、PCR易受污染的影響，因?yàn)樗且环N敏感的擴(kuò)增技術(shù)。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴(kuò)增。當(dāng)前一次擴(kuò)增產(chǎn)物用來進(jìn)行新的擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，會(huì)發(fā)生共同來源的污染。這稱之為殘余污染。從其它樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會(huì)是污染源(非殘余污染)。
2、可以在PCR過程中使用良好的實(shí)驗(yàn)步驟減少殘余污染。為PCR樣品配制和擴(kuò)增后分析設(shè)計(jì)隔離的區(qū)域，在準(zhǔn)備新反應(yīng)前更換手套?？偸鞘褂貌缓心０宓年幮詫?duì)照檢測(cè)污染。使用預(yù)先混合的反應(yīng)成份，而不是每個(gè)反應(yīng)的每個(gè)試劑單獨(dú)加入。
送檢與交付標(biāo)準(zhǔn)
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運(yùn)輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 動(dòng)物組織 | 單個(gè)樣品>0.1g，2mlEP管或凍存管裝，不要過量；樣本應(yīng)盡量新鮮，如不能立即提取蛋白或核酸，應(yīng)液氮速凍后凍存于-80℃或更低，凍存樣本避免反復(fù)凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記，且標(biāo)記清晰可識(shí) |
| 種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本，單個(gè)樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 貼壁/懸浮細(xì)胞 | 1. 總RNA或蛋白：106cell/指標(biāo)、漿/核RNA或蛋白：107cell/指標(biāo)、線粒體RNA或蛋白：2*107 cell/指標(biāo)，樣本盡量新鮮，細(xì)胞收取后直接加Trizol（QPCR檢測(cè)）或直接凍存于-80℃ 2. 若細(xì)胞處理（加藥、轉(zhuǎn)染、感染）后狀態(tài)差應(yīng)酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白細(xì)胞勻漿>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蠟包埋樣品 | 由標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊，有效厚度大于 0.1cm； 新鮮的 FFPE 組織切片，每片厚度不超過 10μm，2~8 張，表面積不超過 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿足相應(yīng)實(shí)驗(yàn)要求的抗體； 2. 按抗體說明書要求寄送，盡量避免分裝；如分裝，確保量足夠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并提供抗體說明書。 3.保存抗體的抗體管上應(yīng)有能夠識(shí)別此抗體的標(biāo)記，抗體的量應(yīng)大于實(shí)驗(yàn)所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)基因至少提供兩對(duì)引物， 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |
電話：400-691-6686
在線時(shí)間：8:00-24:00
微信關(guān)注公眾號(hào)
湘公網(wǎng)安備