CRISPR/Cas9載體構(gòu)建
CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作原理是crRNA (CRISPR-derived RNA) 通過(guò)堿基配對(duì)與 tracrRNA (trans-activating RNA) 結(jié)合形成tracrRNA/crRNA 復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對(duì)的序列靶位點(diǎn)處剪切雙鏈 DNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組DNA序列進(jìn)行編輯；而通過(guò)人工設(shè)計(jì)這兩種 RNA，可以改造形成具有引導(dǎo)作用的gRNA (guide RNA)，用以引導(dǎo) Cas9 對(duì) DNA 的定點(diǎn)切割。
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實(shí)驗(yàn)介紹
【技術(shù)原理】
CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作原理是crRNA (CRISPR-derived RNA) 通過(guò)堿基配對(duì)與 tracrRNA (trans-activating RNA) 結(jié)合形成tracrRNA/crRNA 復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對(duì)的序列靶位點(diǎn)處剪切雙鏈 DNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組DNA序列進(jìn)行編輯；而通過(guò)人工設(shè)計(jì)這兩種 RNA，可以改造形成具有引導(dǎo)作用的gRNA (guide RNA)，用以引導(dǎo) Cas9 對(duì) DNA 的定點(diǎn)切割。
1、靶位點(diǎn)的選擇要求：靶位點(diǎn)主要包括20 個(gè)堿基，并且這20 個(gè)堿基后面是NGG的PAM 區(qū)；靶位點(diǎn)盡量選擇在基因編碼區(qū)的前端；
2、背景載體的選擇要求：根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的功能載體；
3、轉(zhuǎn)化應(yīng)選擇對(duì)應(yīng)抗性的LB平板培養(yǎng)基。
【實(shí)驗(yàn)流程】
案例展示
送檢與交付標(biāo)準(zhǔn)
| 樣品類(lèi)型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運(yùn)輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 動(dòng)物組織 | 單個(gè)樣品>0.1g，2mlEP管或凍存管裝，不要過(guò)量；樣本應(yīng)盡量新鮮，如不能立即提取蛋白或核酸，應(yīng)液氮速凍后凍存于-80℃或更低，凍存樣本避免反復(fù)凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記，且標(biāo)記清晰可識(shí) |
| 種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本，單個(gè)樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 貼壁/懸浮細(xì)胞 | 1. 總RNA或蛋白：106cell/指標(biāo)、漿/核RNA或蛋白：107cell/指標(biāo)、線(xiàn)粒體RNA或蛋白：2*107 cell/指標(biāo)，樣本盡量新鮮，細(xì)胞收取后直接加Trizol（QPCR檢測(cè)）或直接凍存于-80℃ 2. 若細(xì)胞處理（加藥、轉(zhuǎn)染、感染）后狀態(tài)差應(yīng)酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白細(xì)胞勻漿>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蠟包埋樣品 | 由標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊，有效厚度大于 0.1cm； 新鮮的 FFPE 組織切片，每片厚度不超過(guò) 10μm，2~8 張，表面積不超過(guò) 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿(mǎn)足相應(yīng)實(shí)驗(yàn)要求的抗體； 2. 按抗體說(shuō)明書(shū)要求寄送，盡量避免分裝；如分裝，確保量足夠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并提供抗體說(shuō)明書(shū)。 3.保存抗體的抗體管上應(yīng)有能夠識(shí)別此抗體的標(biāo)記，抗體的量應(yīng)大于實(shí)驗(yàn)所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)基因至少提供兩對(duì)引物， 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |
電話(huà)：400-691-6686
在線(xiàn)時(shí)間：8:00-24:00
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