Tunel染色
基因組DNA斷裂時，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上熒光素 (FITC) 標(biāo)記的dUTP (fluorescein-dUTP) ，從而可以通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，這就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法檢測細(xì)胞凋亡的原理。
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實驗介紹
【技術(shù)原理】
細(xì)胞在發(fā)生凋亡時，會激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細(xì)胞凋亡時抽提DNA進(jìn)行電泳檢測，可以發(fā)現(xiàn)180~200bp的DNA ladder?；蚪MDNA斷裂時，暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上熒光素、生物素標(biāo)記的dUTP，從而可以通過熒光顯微鏡或化學(xué)顯色方法檢測細(xì)胞凋亡的情況。
【實驗流程】
案例展示
技術(shù)總結(jié)
【常見問題】
1、無/弱染色
烤片溫度過高，推薦56℃-60℃1-2h；
一抗是否適用固定液和石蠟切片，使用濃度是否過低，孵育是否時間過短等。
2、染色過深
染色試濃度過高或孵育時間過長；
顯色劑濃度過高或孵育時間過長。
【注意事項】
1、洗滌蛋白酶K時，一定要PBS沖洗3次，如果沖洗不凈會嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)；
2、3%的過氧化氫溶液孵育時間不應(yīng)過長，否則會出現(xiàn)過氧化氫導(dǎo)致的DNA斷裂，產(chǎn)生假陽性；
3、滴加TUNEL檢測液時，可利用防蒸發(fā)膜防止其蒸發(fā)影響樣本的生物素標(biāo)記；配制好的DAB顯色液必須一次性使用完畢，不宜凍存。
送檢與交付標(biāo)準(zhǔn)
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運(yùn)輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 新鮮組織 | 新鮮取材組織，用 PBS 清洗干凈血液等，立即-80℃保存 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記，且標(biāo)記清晰可識 |
| 一般固定組織 | 一般組織體積不超過2cmX2cmX0.5cm，固定時盡量保持組織的原有形態(tài)并清理干凈血液及多余部分，如腸道內(nèi)容物；固定液體積為組織大小的10倍以上，容器足夠容納組織不使其擠壓變形。標(biāo)注好固定液類型和固定時長 | 常溫 | 常溫 | |
| 特殊固定組織 | 睪丸、眼球、脊髓、肌肉等組織：推薦使用對應(yīng)的特殊固定液進(jìn)行固定，以保證固定效果。如Bouin液，適用于睪丸組織、皮膚組織及眼球的固定 | |||
| 組織蠟塊 | 組織由標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋盒包埋（尺寸為30*24*7mm），石蠟與組織要均勻接合，不能有裂痕；蠟塊厚度根據(jù)所需切片的數(shù)量而定，有效厚度至少要超過 0.1cm。盡量提供半年內(nèi)的組織蠟塊，超過半年的蠟塊抗原可能丟失，做免疫組化可能出現(xiàn)檢測不到蛋白。 | 常溫 | 常溫 | |
| 組織切片 | 需用防脫載玻片進(jìn)行撈片，并注明切片厚度、已烤片溫度與時間，組織應(yīng)在靠近切片下端 1/3 處。 | 4℃ | 冰袋 | |
| 細(xì)胞爬片 | 使用 12 孔板或 24 孔板專用細(xì)胞爬片，細(xì)胞爬片經(jīng)固定后用 PBS 洗滌 2~3 次，保存在 PBS 中，用封口膜密封孔板。每個爬片在孔板蓋上應(yīng)有唯一的標(biāo)記，并有電子版的分組信息，以防標(biāo)記在運(yùn)輸途中模糊。 | 常溫 | 常溫 | |
| 植物樣本 | 新鮮組織FAA固定，木質(zhì)化程度不高；對于較薄的葉片，如果要求平行葉片切片，難以保證切完整；根莖要求直徑>1mm | 常溫 | 常溫 | |
| 抗體 | 保存抗體的抗體管上應(yīng)有能夠識別此抗體的標(biāo)記，并附帶說明書，抗體的量應(yīng)大于實驗所需的量。組織切片、組織芯片按稀釋后 100μl 一張切片計算抗體用量， 24 孔板細(xì)胞爬片圓形蓋玻片按稀釋后 200μl 一張計算抗體用量，12 孔板細(xì)胞爬片圓形蓋玻片按稀釋后 400μl 一張計算抗體用量。 | -20℃ | 冰袋或干冰 |
電話：400-691-6686
在線時間：8:00-24:00
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