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實驗介紹
【技術原理】
隨著分子生物學研究尤其是人類基因組計劃的迅速發(fā)展,為適應對眾多基因或蛋白進行功能研究的發(fā)展趨勢,已出現(xiàn)了很多新技術。其中酵母雙雜交技術以其簡便,靈敏,高效以及能反映不同蛋白質(zhì)之間在活細胞內(nèi)的相互作用等特點在基因功能的研究中得到廣泛的應用。
酵母雙雜交系統(tǒng)的建立基于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認識。酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4含兩個結(jié)構(gòu)域:DNA結(jié)合功能域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域,前者可識別DNA上的特異序列,并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)基因的上游,后者同轉(zhuǎn)錄復合體的其他成分作用,啟動相應基因的轉(zhuǎn)錄。將編碼DNA結(jié)合功能域的基因與已知誘餌蛋白質(zhì)基因構(gòu)建在同一個表達載體上,在酵母中表達兩者的融合蛋白,將編碼DNA轉(zhuǎn)錄激活域的基因和cDNA文庫的基因構(gòu)建在AD-LIBRARY表達載體上,同時將上述兩種載體轉(zhuǎn)化改造后的酵母。當兩種載體所表達的融合蛋白能夠相互作用時,功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報告基因,從而通過功能互補和顯色反應篩選到陽性菌落。將陽性反應的酵母菌株中的AD-LIBRARY載體提取分離出來,從而對載體中插入的文庫基因進行測序和分析工作。
酵母雙雜交實驗原理圖
【實驗流程】
案例展示
酵母雙雜交系統(tǒng)(two-hybrid system)案例一
酵母雙雜交系統(tǒng)(two-hybrid system)案例二
送檢與交付標準
樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運輸條件 | 備注 |
---|---|---|---|---|
動物組織 | 單個樣品>0.1g,2mlEP管或凍存管裝,不要過量;樣本應盡量新鮮,如不能立即提取蛋白或核酸,應液氮速凍后凍存于-80℃或更低,凍存樣本避免反復凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標記,且標記清晰可識 |
種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本,單個樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
貼壁/懸浮細胞 | 1. 總RNA或蛋白:106cell/指標、漿/核RNA或蛋白:107cell/指標、線粒體RNA或蛋白:2*107 cell/指標,樣本盡量新鮮,細胞收取后直接加Trizol(QPCR檢測)或直接凍存于-80℃ 2. 若細胞處理(加藥、轉(zhuǎn)染、感染)后狀態(tài)差應酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml,骨髓 1~3ml; -80℃保存不超半周的白細胞勻漿>400μl,每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
石蠟包埋樣品 | 由標準的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊,有效厚度大于 0.1cm; 新鮮的 FFPE 組織切片,每片厚度不超過 10μm,2~8 張,表面積不超過 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿足相應實驗要求的抗體; 2. 按抗體說明書要求寄送,盡量避免分裝;如分裝,確保量足夠進行實驗,并提供抗體說明書。 3.保存抗體的抗體管上應有能夠識別此抗體的標記,抗體的量應大于實驗所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
引物 | 干粉,≥1OD,如進行預實驗,每個基因至少提供兩對引物, 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |