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實驗介紹
實驗原理
通過PARISTM Kit Protein and RNA Isolationg System 核質分離試劑盒將細胞的胞核與胞質分開，提取這兩部分的RNA，進行QP檢測。檢測胞質與胞核中目的基因及內參基因的表達在細胞總表達的占比。
實驗方法
Step1: 細胞收集之后，預冷的PBS清洗一遍，3000g離心5min后取上清，置于冰上。加入合適體積預冷的Cell Fractionation Bufeer 重懸細胞，輕輕打勻。冰上孵育10min。
Step2: 孵育10分鐘后，500g，4℃離心5min，分離胞漿和胞核。上清轉移至新的無RNA酶的EP管中，置于冰上，此為胞漿。
Step3: 胞核沉淀加入預冷的Cell Fractionation Bufeer 重懸，吹打混勻后500g，4℃離心1min，去上清。胞核沉淀中加入預冷的Cell Disruption Buffer ,冰上裂解至溶液均一。(裂解至溶液透明）
Step4: 胞漿和胞核中分別加入等體積的2X Lysis/Binding Solution，上下顛倒混勻，室溫裂解。
Step5: 加入與裂解液相同體積的無水乙醇，混合均勻。
Step6: 將混合液分別置于濾柱中過濾，10000g，室溫離心1min,丟棄EP管，轉移濾柱至試劑盒提供的EP管中進行清洗。
Step7: 加入700ulWash SolutionⅠ10000g，室溫離心1min。倒掉液體，濾柱中加入500ulWash Solution2/3，10000g，室溫離心,10000g,室溫離心1min
Step8：倒掉廢液，空管離心一次，10000g，室溫離心1min,更換EP管。
Step9：DEPC水加熱到95-100℃加35ul至濾柱中央，10000g室溫離心30s。丟棄濾柱，分別得到胞漿和胞核的RNA。
案例展示
左：擴增曲線； 右：溶解曲線
通過監(jiān)測不同循環(huán)階段的熒光強度，直至曲線平滑達到細胞中該基因的表達高峰。Ct值越低，表達越高。
通過2-meanCt公式計算基因在胞核與胞質的表達大小，繪制柱狀圖，得到基因在胞核與胞質中的表達占比。
技術總結
注意事項：
1. 2X Lysis/Binding Solution可能在4°C下凝固。使用前，將溶液加熱至37°C，偶爾攪拌5-10分鐘，或直至完全溶解。
2. 洗脫水需要在95-100℃水浴鍋中預熱，更好的洗脫柱膜上的RNA，不過由于洗脫溫度過高可能會導致RNA有些許降解。
交付標準
1. 實驗報告
2. 真實實驗結果
3. 原始圖片
4. 實驗原始數(shù)據(jù)
5. 剩余物料在周期內可返還（超過周期，不予返還）
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