Co-IP、ChIP、RIP、Pulldown作為常見的關(guān)系驗(yàn)證方法。它們可以從檢驗(yàn)的出發(fā)點(diǎn)來區(qū)分：co-IP、ChIP、RIP是利用已知的蛋白檢測體內(nèi)相關(guān)蛋白、DNA、RNA，并通過蛋白抗體免疫沉淀分離目標(biāo)蛋白、DNA、RNA。Pulldown則是根據(jù)已知RNA（RNA pulldown）或者已知蛋白（GST pulldown）體外檢驗(yàn)相關(guān)蛋白。

免疫共沉淀co-IP

抗體與細(xì)胞裂解液或蛋白表達(dá)上清中相應(yīng)的蛋白結(jié)合后，再與蛋白A/G（ProteinA/G）（或二抗）偶聯(lián)的瓊脂糖微珠孵育，通過離心得到微珠-蛋白A/G（或二抗）-抗體-目的蛋白復(fù)合物。復(fù)合物沉淀經(jīng)離心洗滌后，重懸于電泳上樣緩沖液，沸水浴5-10 min，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，離心收集上清，上清中包括抗體（輕鏈和重鏈已斷開）和靶標(biāo)蛋白。該上清混合物經(jīng)SDS-PAGE電泳分離和Western blotting顯影，最終依據(jù)顯影后的膠片上是否有目的蛋白條帶，來判斷免疫沉淀實(shí)驗(yàn)是否成功。

實(shí)驗(yàn)方法

Step1: 蛋白樣品準(zhǔn)備，細(xì)胞需提前裂解

Step2: 抗原抗體結(jié)合

Step3: protein A 瓊脂糖珠與抗體結(jié)合

Step4: 免疫沉淀分離

Step5: 洗脫蛋白復(fù)合物

Step6: WB或質(zhì)譜分析

染色質(zhì)免疫沉淀ChIP

ChIP是目前唯一研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。在生理狀態(tài)下，把細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，通過超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)， 將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來，以富集存在組蛋白修飾或者轉(zhuǎn)錄調(diào)控的DNA片段，再通過多種下游檢測技術(shù)（定量PCR、基因芯片、測序等）來檢測此富集片段的DNA序列。

實(shí)驗(yàn)方法

Step1: 交聯(lián)蛋白與DNA

Step2: 超聲破碎使染色質(zhì)片段化

Step3:細(xì)胞裂解

Step4: 抗體結(jié)合特定蛋白抗原

Step5: 通過beads沉淀復(fù)合物并洗脫

Step6: qPCR擴(kuò)增或基因測序

RNA免疫沉淀RIP

主要是用來研究體內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況，利用針對目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來，通過分離純化，對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA 進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證或測序分析，了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)過程。

實(shí)驗(yàn)方法

Step1：靶蛋白-RNA交聯(lián)形成復(fù)合物（RNP）超聲剪切RNA鏈成小段

Step2：細(xì)胞裂解，將RNP與抗體、微珠連接

Step3：微珠-抗體-RNP形成沉淀

Step4：將RNP從微珠-抗體上洗脫，并將RNA與蛋白解交聯(lián)，純化RNA

Step5：qPCR檢測或測序分析

RNA Pulldown

RNA Pulldown是研究RNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種技術(shù)。利用生物素標(biāo)記的RNA探針，通過與含有目的蛋白的溶液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。復(fù)合物可以特異性結(jié)合磁珠，從而與孵育液中的其他蛋白分離。復(fù)合物洗脫后，通過蛋白凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，檢測特定的RNA與蛋白的結(jié)合情況。

實(shí)驗(yàn)方法

Step1：生物素標(biāo)記目標(biāo)目標(biāo)RNA；

Step2：磁珠結(jié)合目標(biāo)RNA；

Step3：目標(biāo)RNA與蛋白結(jié)合；

Step4：通過磁場固定磁珠，將蛋白分離純化；

Step5：通過WB鑒定或質(zhì)譜檢測。

GST Pulldown

GST Pulldown將靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶）融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上,作為與目的蛋白親和的支撐物，充當(dāng)一種“誘餌蛋白”，目的蛋白溶液過柱，可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白)，洗脫結(jié)合物后通過SDS-PAGE電泳分析，從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白，“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過細(xì)胞裂解物、純化蛋白、表達(dá)系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。

體外檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用，用于驗(yàn)證兩個(gè)已知蛋白的相互作用，或者篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白。

實(shí)驗(yàn)方法

Step1：Glutathione瓊脂糖珠預(yù)處理；

Step2：GST融合蛋白掛柱；

Step3：細(xì)胞裂解；

Step4：將細(xì)胞裂解液上清加入beads；

Step5：加上SDS上樣緩沖液；

Step6：SDS-PAGE，Western Blot或者質(zhì)譜儀分析。

案例展示

ChIP案例分析：

1. 陽性對照組條帶清晰可見，陰性對照組正常，表明CHIP實(shí)驗(yàn)操作可行；

2. input對照組條帶清晰可見，表明PCR擴(kuò)增引物可用；

3. 抗體A實(shí)驗(yàn)組有目的條帶，表明基因與轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白均可發(fā)生結(jié)合。

RIP案例分析：

1. 陽性對照組條帶清晰可見，陰性對照組正常，表明RIP實(shí)驗(yàn)操作可行；

2. input對照組條帶清晰可見，表明PCR擴(kuò)增引物可用；

3. 抗體A實(shí)驗(yàn)組有目的條帶，表明RNA與蛋白可發(fā)生結(jié)合。