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——檢測293T細胞中Myc的表達
前兩篇我們總結了Western blot實驗結果中WB檢測實驗報告和詳細的操作步驟（上）今天來學習WB實驗操作下篇，希望大家學習參考，能夠順利進行實驗，普拉特澤表達檢測實驗平臺長期為大家提供WB實驗代做外包服務。

一、實驗目的

利用Western Blot技術檢驗不同的處理之后，293T細胞中Myc蛋白的表達量變化。

二、實驗樣本及分組

2.1 實驗樣本

2.2 實驗分組
細胞：293T細胞

分組：Control、pCMV-Myc、EGFR-TK-pCMV-Myc、EGFR-TK(S720A)-pCMV-Myc

三、實驗結果

3.1 抗體工作信息

3.2 WB檢測293T細胞中Myc的蛋白水平

圖1 Myc的WB表達水平檢測圖

圖2Myc的WB檢測灰度數(shù)據柱形圖

四、實驗材料

5.1主要儀器

5.2主要試劑

五、實驗原理

蛋白免疫印跡( Western Blot) 采用的是聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的特異性抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。

六、實驗步驟

7.1.蛋白提取

(1)樣本的收集：

細胞：用1 ml生理鹽水對離心下來的細胞進行洗滌，同時將其轉移至1.5 ml的離心管中。

組織：取適量組織剪碎，研磨勻漿。

(2)按1 ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合。）

(3)根據細胞量的多少，每管細胞加100-500 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min。

(4)4℃下12000 rpm離心10 min。離心后的上清分裝轉移至1.5 ml的離心管中，用于蛋白定量檢測。若不能及時定量蛋白濃度，請置于－80℃保存。

7.2.蛋白定量及處理（BCA法）

(1)使用時將BCA試劑盒中 Solution A搖晃混勻，根據樣品數(shù)量，按50體積Solution A加1體積Solution B(50:1)配置適量BCA工作液，充分混勻后即成淡綠色的工作液。BCA工作液室溫24 h內穩(wěn)定。

(2)將標準品（1mg/ml BSA）按0、1、2、4、6、8、10 μl的量分別加入96孔板中，再加入去離子水將所有標準品補足到10 μl。

(3)加1 μl的樣品到96孔板中，加去離子水補足到10 μl。

(4)各孔加入200 μl BCA工作液，輕輕用移液器吹打混勻（注意不要產生氣泡以免影響讀數(shù)），37℃孵育30 min。

(5)冷卻到室溫后，用酶標儀測定A562的吸光度值。

(6)根據標準曲線計算出樣品中的蛋白濃度。

(7)蛋白變性處理：蛋白溶液與5×loading buffer 按照體積比4：1混勻（此時蛋白濃度變成實際檢測濃度的0.8倍），置于沸水中煮10min，冷卻后進行SDS-PAGE電泳，或儲存于-80℃，避免反復凍融。

(8)蛋白濃度的計算公式

舉例標曲為：Y=aX+b(Y為OD值，X為測定濃度）

樣品蛋白濃度=[（Y-b）/a]×稀釋倍數(shù)

7.3.Western Blot

(1)配制分離膠和濃縮膠：根據目的蛋白分子量大小，配分離膠和5%濃縮膠；

蛋白分子量（kDa）分離膠濃度%

：計算含20~80 μg蛋白的溶液體積，即為上樣量。用1×loading buffer 補至每個加樣孔的總體積一致；

(3)電泳：濃縮膠電壓為80 V，40 min，分離膠電壓120 V，30-50 min。溴酚藍跑至膠底即可終止電泳，進行轉膜；

(4)轉膜：恒壓100V，0.45/0.22 μm PVDF膜；

(5)封閉： 將PVDF膜完全浸沒在5% milk-PBST或5% BSA-PBST中，室溫輕搖60 min或4℃過夜；

(6)一抗孵育：用5% BSA-PBST稀釋一抗，4℃孵育過夜；

(7)洗膜：次日取出PVDF膜，PBST洗膜5次，每次6 min；

(8)二抗孵育：PBST稀釋二抗，室溫孵育60 min；

(9)洗膜：PBST洗膜5次，每次6 min；

(10)顯影：ECL A和B液按體積1:1混合后均勻滴加在膜上，按需求設置曝光時間及曝光類型，開始曝光，曝光結束后保存圖片并導出圖片。

7.4.圖像分析

用圖像分析軟件Image J對圖像進行灰度分析。

好啦，WB檢測實驗報告和詳細的操作步驟（下）咱們就介紹完啦，如果您也對WB實驗感興趣或正在準備WB實驗的話歡迎隨時咨詢普拉特澤生物~