熒光定量PCR結(jié)果分析解讀—熒光定量PCR外包
2022-07-26 11:17:27
來源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺
大家好，今天普拉特澤生物跟大家一起學(xué)習(xí)的是熒光定量PCR實驗結(jié)果的分析與解讀，上期我們學(xué)習(xí)了熒光定量PCR實驗的操作步驟，不記得的可以點擊回去復(fù)習(xí)哦。普拉特澤生物表達檢測平臺專業(yè)承接熒光定量PCR實驗外包與代做服務(wù)，本文我們就來一點一點看，熒光定量PCR結(jié)果到底應(yīng)該如何分析與解讀。
1、基線
基線是指實時PCR反應(yīng)的基線是指在PCR的初始循環(huán)期間的信號水平，通常是3至15的循環(huán)之間，此時熒光信號幾乎沒有變化。此時低信號可以認為是背景或反應(yīng)的“噪音”?；€應(yīng)該設(shè)置應(yīng)考慮，在消除早期擴增循環(huán)中背景的同時，不覆蓋掉明顯非背景的擴增信號。當(dāng)比較不同的qPCR反應(yīng)或?qū)嶒灂r，應(yīng)定義同一基線。
2、閾值
qPCR的閾值代表的是明顯超出基線的擴增信號水平，用以區(qū)分明確的擴增信號和背景。通常，qPCR儀器自帶軟件會自動將閾值設(shè)置為基線熒光值標準偏差的10倍。
3、CT
Ct是指熒光信號超過閾值時對應(yīng)的循環(huán)數(shù)。Ct值與目的基因的起始量成反比，可用于計算DNA初始拷貝數(shù)。隨著模板量減少，檢測到顯著擴增時的循環(huán)數(shù)會增加。
4、擴增曲線
擴增曲線 早期循環(huán)中，熒光信號幾乎沒有變化。隨著反應(yīng)的進行，每個循環(huán)的熒光水平開始顯著上升，被稱為指數(shù)期。一般在在指數(shù)期的早期階段而不是后期的平臺期進行定量分析。在指數(shù)階段開始時，所有的試劑仍然是過量的，DNA聚合酶仍然高效，并且擴增產(chǎn)物量還較低，不會在退火時與引物競爭。這些因素都有助于更準確的定量。
5、溶解曲線
熔解曲線 熔解曲線描繪了隨著反應(yīng)溫度升高，摻入染料分子的dsDNA解離成單鏈DNA（ssDNA）時的熒光變化。例如，當(dāng)結(jié)合SYBR? Green I染料的dsDNA被加熱時，達到解鏈溫度（Tm）后，由于雙聯(lián)DNA鏈解離而釋放出染料，熒光信號會急劇降低。以熒光信號隨時間變化作圖可得到圖3A，然后以ΔF/ΔT（熒光變化/溫度變化）值與溫度作圖，可得到熔融動力學(xué)的清晰視圖（圖3B）?？梢愿鶕?jù)熔解曲線來判斷qPCR反應(yīng)的特異性，特異性的擴增的溶解曲線會是一個緊密的單峰。
6、相對定量
相對定量，不像絕對量化嚴格，應(yīng)用于大多數(shù)基因表達水研究。相對定量關(guān)注的并非某個基因的絕對表達量，而是同一基因在樣本間的表達差異(如實驗組和對照組)。結(jié)果以處理組相對于未處理組的表達差異倍數(shù)表示。這種分析方法不需要測定精確的拷貝數(shù)，重點是在與未處理樣品組相比的表達變化上。
相對定量算法—ΔΔCt ΔΔCt方法是比較組別間同一基因表達差異的常用方法。通過將目的基因Ct(Ct 目的)與自身內(nèi)參Ct值（Ct 內(nèi)參）進行比較，可得到每一組別的ΔCt，再將實驗組與對照組進行計算得到ΔΔCt。ΔΔCt的大小關(guān)聯(lián)目的基因表達水平的倍數(shù)差異大小。
倍數(shù)差異 = 2–ΔΔCt
ΔCt 實驗組 – ΔCt 對照組 = ΔΔCt
Ct 目的 實– Ct 內(nèi)參 實 = ΔCt 實驗組
Ct 目的 對– Ct 內(nèi)參 對照 = ΔCt 對照組
好啦，實驗結(jié)果的數(shù)據(jù)應(yīng)該怎么分析以及數(shù)據(jù)的意義咱們就講到這里啦，如果您還有更多的問題，歡迎您留言跟咱們的技術(shù)一起留言討論，如果您需要熒光定量PCR實驗代做與外包的服務(wù)，請一定記得您生物科研路上的好盟友——普拉特澤！
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