ELISA酶聯(lián)免疫吸附實驗詳細操作步驟【附視頻教程】
2022-04-07 13:27:43
來源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學整體課題外包平臺
ELISA酶聯(lián)免疫吸附實驗的詳細步驟由普拉特澤生物旗下科研培訓品牌——春風學院給大家總結分享，普拉特澤生物自建3000㎡生物實驗室，專業(yè)承接各類生物實驗外包服務，ELISA作為表達檢測平臺的常規(guī)實驗，承接了上千例的實驗代做，積累了豐富的實操經(jīng)驗，文章末更為大家附上ELISA實驗的視頻教程，一起來學習吧！
上篇給大家講到，ELISA分為多種不同的檢測方法，今天我們就從直接法ELISA、間接法ELISA、夾心法ELISA、競爭法ELISA四種方法給大家詳細講解。
一、直接法ELISA詳細實驗步驟
將抗原按一定的比例稀釋好包被到固相載體上，然后加入稀釋好的特異性的酶標抗體，孵育后加入底物顯色并判讀結果。
直接ELISA操作很簡單，步驟也比較簡練，但是其應用范圍還是非常有限的，一個重要的原因是這種ELISA中只經(jīng)過了一步信號放大（酶的放大），所以其靈敏度不是很高；另外，其測定的對象也非常有限，只能測定酶標記的分子。
二、間接法ELISA詳細實驗步驟（具體操作可以參考說明書哦）
1、包被抗原：用包被緩沖液稀釋抗原至最適濃度（5～20 ug/ml）各0.3 ml加于微反應板每個凹孔中,4℃過夜或37℃水浴2～3小時，貯存冰箱。
2、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
3、加被檢標本：每凹孔加入用含有0.05%吐溫-20的稀釋緩沖液稀釋的被檢血清各0. 2 mL，37℃，作用1～2小時。
4、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
5、加入酶結合物：每凹孔加入稀釋緩沖液稀釋的酶結合物0.2 mL37℃作用1～2小時。
6、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
7、加入0.2 mL底物溶液于每個凹孔（OPD或OT），室溫作用30分鐘（另作一空白對照，0.4 mL底物加0.1 mL終止劑）。
8、加終止劑：每凹孔加2 M H2SO4或2 M檸檬酸0.05 mL。
9、觀察記錄結果：目測或用酶標比色計測定（OPD用492 nm）OD值。
三、夾心法ELISA詳細實驗步驟
1、將具有專一性的抗體固著（coating）于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗體。
2、 加入待測檢體，檢體中若含有待測的抗原，則其會與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結。
3、洗去多余待測檢體，加入另一種對抗原專一的一次抗體，與待測抗原進行鍵結。
4、洗去多余未鍵結一次抗體，加入帶有酶的二次抗體，與一次抗體鍵結。
5、洗去多余未鍵結二次抗體，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或儀器讀取呈色結果。
四、競爭法ELISA詳細實驗步驟
1、包被抗體：用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至最適濃度（1～10 ug /ml），每凹孔加0.3 ml，4℃過夜，或37℃水浴3小時，貯存冰箱。
2、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
3、分2組，a組加酶標記抗原和被檢抗原混合液0.2 ml，b組只加酶標記抗原液0.2 ml，37℃作用1～2小時。（混合液可作成不同稀釋度）
4、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
5、加入0.2 ml底物溶液于每個凹孔（OPD或OT），室溫作用30分鐘（另作一空白對照，0.4 ml底物加0.1 mL終止劑）。
6、加終止劑：每凹孔加2 M H2SO4或2 M檸檬酸0.05 mL。
7、用酶標比色計測定a、b兩組OD值，并求出a、b、OD值的差數(shù)。
好啦，ELISA實驗的詳細實驗操作步驟我們就分享那個到這里啦，沒看懂的可以點擊：ELISA理論+實操更加認真學習哦~需要更多生物實驗學習或外包的同學歡迎隨時留言哦~
電話：400-691-6686
在線時間：8:00-24:00
微信關注公眾號
湘公網(wǎng)安備