定點(diǎn)突變
目前，由PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變相比于其他突變技術(shù)具有周期短、成功率高、不受酶切位點(diǎn)限制等優(yōu)點(diǎn)，是使用最普遍的定點(diǎn)突變方法。
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實(shí)驗(yàn)介紹
【技術(shù)原理】
DNA分子中由于發(fā)生堿基對(duì)的增添、缺失或改變進(jìn)而引起基因結(jié)構(gòu)的改變，稱為基因突變。定點(diǎn)突變 （mutagenesis）是通過PCR等方法向目的DNA片段中引入突變，包括堿基的添加、刪除、點(diǎn)突變等。該技術(shù)能迅速、高效地改變DNA所表達(dá)的目的蛋白的性狀及表征，是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間復(fù)雜關(guān)系的有力工具，也是研究人員在實(shí)驗(yàn)室中改造、優(yōu)化基因常用的一種非常有用的手段。目前，由PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變相比于其他突變技術(shù)具有周期短、成功率高、不受酶切位點(diǎn)限制等優(yōu)點(diǎn)，是使用最普遍的定點(diǎn)突變方法。
【實(shí)驗(yàn)流程】
案例展示
常見問題
常見問題1：質(zhì)粒模板無法正常擴(kuò)增
可能原因及解決方法：
（1）引物設(shè)計(jì)有誤：核對(duì)引物設(shè)計(jì)方案；
（2）擴(kuò)增體系配制錯(cuò)誤：重復(fù)實(shí)驗(yàn)；
（3） 擴(kuò)增反應(yīng)條件不優(yōu)化：調(diào)整Mg濃度、酶量、擴(kuò)增程序；
（4）模板質(zhì)粒質(zhì)量偏差：長(zhǎng)期放置、反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致模板質(zhì)粒斷裂、開環(huán)或降解，應(yīng)使用新鮮制備的質(zhì)粒作為模板。
常見問題2：平板上長(zhǎng)不出克隆或克隆數(shù)目很少
可能原因及解決方法：
（1）感受態(tài)效率低：使用新制備或妥善凍存的感受態(tài)細(xì)胞，確保轉(zhuǎn)化效率>cfuμg。每次可設(shè)置一組轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率；
（2）重組反應(yīng)體系中DNA量不足,或者比例不佳(雙堿基突變)：盡量按照推薦DNA的量配制反應(yīng)體系；
（3） 重組環(huán)化反應(yīng)體系中DNA不純,抑制反應(yīng)：未純化DpnI消化產(chǎn)物加入重組反應(yīng)體系內(nèi)的總體積不應(yīng)超過μl(反應(yīng)體系體積)。嘗試對(duì)DpnI消化產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化；
（4）感受態(tài)細(xì)胞中加入了過多的反應(yīng)產(chǎn)物：反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的，否則會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率；
（5）出現(xiàn)轉(zhuǎn)化抑制效應(yīng)：當(dāng)轉(zhuǎn)化的DNA濃度太高時(shí)，會(huì)抑制轉(zhuǎn)化反應(yīng)。將重組反應(yīng)產(chǎn)物稀釋倍后取進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
常見問題3：定點(diǎn)突變未正確完成
可能原因及解決方法：
（1）引物設(shè)計(jì)錯(cuò)誤：核對(duì)引物設(shè)計(jì)方案；
（2）擴(kuò)增反應(yīng)所用模板為非甲基化的質(zhì)粒：DpnI只能識(shí)別甲基化DNA，請(qǐng)務(wù)必使用從甲基化酶無缺陷的宿主菌中擴(kuò)增的質(zhì)粒作為PCR模板；
（3）擴(kuò)增反應(yīng)使用過多的模板質(zhì)粒：對(duì)于大多數(shù)質(zhì)粒，ng模板量已足以使擴(kuò)增反應(yīng)正常進(jìn)行，過多的質(zhì)粒模板將會(huì)導(dǎo)致DpnI消化不完全，降低突變成功率。
常見問題4：非目標(biāo)位點(diǎn)突變
可能原因及解決方法：
（1）模板質(zhì)粒攜帶未知位點(diǎn)突變：測(cè)序確認(rèn)模板質(zhì)粒序列正確性。
（2）擴(kuò)增循環(huán)數(shù)過多：為了防止擴(kuò)增過程中引入非目標(biāo)突變，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)不宜超過30。如果擴(kuò)增效率良好的話，推薦擴(kuò)增循環(huán)數(shù)應(yīng)不超過35。
送檢與交付標(biāo)準(zhǔn)
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運(yùn)輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 動(dòng)物組織 | 單個(gè)樣品>0.1g，2mlEP管或凍存管裝，不要過量；樣本應(yīng)盡量新鮮，如不能立即提取蛋白或核酸，應(yīng)液氮速凍后凍存于-80℃或更低，凍存樣本避免反復(fù)凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記，且標(biāo)記清晰可識(shí) |
| 種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本，單個(gè)樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 貼壁/懸浮細(xì)胞 | 1. 總RNA或蛋白：106cell/指標(biāo)、漿/核RNA或蛋白：107cell/指標(biāo)、線粒體RNA或蛋白：2*107 cell/指標(biāo)，樣本盡量新鮮，細(xì)胞收取后直接加Trizol（QPCR檢測(cè)）或直接凍存于-80℃ 2. 若細(xì)胞處理（加藥、轉(zhuǎn)染、感染）后狀態(tài)差應(yīng)酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白細(xì)胞勻漿>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蠟包埋樣品 | 由標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊，有效厚度大于 0.1cm； 新鮮的 FFPE 組織切片，每片厚度不超過 10μm，2~8 張，表面積不超過 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿足相應(yīng)實(shí)驗(yàn)要求的抗體； 2. 按抗體說明書要求寄送，盡量避免分裝；如分裝，確保量足夠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并提供抗體說明書。 3.保存抗體的抗體管上應(yīng)有能夠識(shí)別此抗體的標(biāo)記，抗體的量應(yīng)大于實(shí)驗(yàn)所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)基因至少提供兩對(duì)引物， 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |
電話：400-691-6686
在線時(shí)間：8:00-24:00
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