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考馬斯亮藍染色

考馬斯亮藍有G250和R250兩種。其中考馬斯亮藍G250由于與蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)十分迅速,常用來作為蛋白質(zhì)含量的測定??捡R斯亮藍R250與蛋白質(zhì)反應(yīng)雖然比較緩慢,但是可以被洗脫下去,所以可以用來對病理組織內(nèi)的蛋白質(zhì)進行染色。

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實驗介紹

【實驗原理】

考馬斯亮藍在游離狀態(tài)下呈紅色,最大光吸收在488nm;當它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?,蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比,因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。


【實驗方法】

Step1石蠟切片常規(guī)操作脫蠟水化;

Step2:切片復(fù)水后經(jīng)過7%(v/v)醋酸1~2min

Step3:放入考馬斯藍R染色液中染色15min;

Step4:自水清洗5min后經(jīng)過蒸餾水;

Step5:水:依次經(jīng)85%、95%Ⅰ、95%Ⅱ10秒,無水乙醇Ⅰ30s、無水乙醇Ⅱ1min;

Step6:透明:經(jīng)二甲苯Ⅰ1min、二甲苯Ⅱ2min;

Step7:中性樹膠固封,鏡檢。


案例展示

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技術(shù)總結(jié)

【常見問題】

1、染色時間過長或過短導(dǎo)致的染色過深或過淺;

2、分化液分化時間過長,導(dǎo)致組織染色陽性過淺;

3、特殊組織如植物組織較脆,易出現(xiàn)掉片。


【注意事項】

1、控制染色時間,保證染色不至于過深或過淺,必要時可在顯微鏡下觀察控制染色時間;

2、分化時間不易過長,保證陽性顯色清晰可見;

3、特殊組織切片時應(yīng)控制切片厚度以及攤片時間,減少掉片風險。


送檢與交付標準

樣品類型樣品需求保存條件運輸條件備注
新鮮組織新鮮取材組織,用 PBS清洗干凈血液等,立即-80℃保存;-80℃干冰所有樣本均須有唯一標記,且標記清晰可識。
一般固定組織一般組織體積不超過2cmX2cmX0.5cm,固定時盡量保持組織的原有形態(tài)并清理干凈血液及多余部分,如腸道內(nèi)容物;固定液體積為組織大小的10倍以上,容器足夠容納組織不使其擠壓變形。標注好固定液類型和固定時長;常溫常溫
特殊固定組織睪丸、眼球、脊髓、肌肉等組織:推薦使用對應(yīng)的特殊固定液進行固定,以保證固定效果。如Bouin液,適用于睪丸組織、皮膚組織及眼球的固定;

組織蠟塊組織由標準的石蠟包埋盒包埋(尺寸為30*24*7mm),石蠟與組織要均勻接合,不能有裂痕;蠟塊厚度根據(jù)所需切片的數(shù)量而定,有效厚度至少要超過0.1cm。盡量提供半年內(nèi)的組織蠟塊,超過半年的蠟塊抗原可能丟失,做免疫組化可能出現(xiàn)檢測不到蛋白;常溫常溫
組織切片需用防脫載玻片進行撈片,并注明切片厚度、已烤片溫度與時間,組織應(yīng)在靠近切片下端 1/3 處;4℃冰袋
細胞爬片使用 12 孔板或 24孔板專用細胞爬片,細胞爬片經(jīng)固定后用 PBS 洗滌 2~3 次,保存在 PBS 中,用封口膜密封孔板。每個爬片在孔板蓋上應(yīng)有唯一的標記,并有電子版的分組信息,以防標記在運輸途中模糊;常溫常溫
植物樣本新鮮組織FAA固定,木質(zhì)化程度不高;對于較薄的葉片,如果要求平行葉片切片,難以保證切完整;根莖要求直徑>1mm;常溫常溫
抗體保存抗體的抗體管上應(yīng)有能夠識別此抗體的標記,并附帶說明書,抗體的量應(yīng)大于實驗所需的量。組織切片、組織芯片按稀釋后 100μl 一張切片計算抗體用量, 24 孔板細胞爬片圓形蓋玻片按稀釋后 200μl一張計算抗體用量,12 孔板細胞爬片圓形蓋玻片按稀釋后 400μl 一張計算抗體用量。-20℃冰袋或干冰


病理交付標準.jpg