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  原位雜交檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告（五）由普拉特澤生物技術(shù)為大家總結(jié)分享。本文是關(guān)于原位雜交檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告的最后一篇介紹，前面我們學(xué)習(xí)了原位雜交檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告（一）、原位雜交檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告（二）、熒光原位雜交檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告（三）以及原位雜交檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告（四），可以點(diǎn)擊標(biāo)題直接傳送回去學(xué)習(xí)的哦。普拉特澤生物分子檢測(cè)平臺(tái)承接酵母雙雜實(shí)驗(yàn)外包上百例，早就為大家把實(shí)驗(yàn)過程中要踩的雷、吃的虧幫大家吃完了，現(xiàn)在我們就來看看，原位雜交檢測(cè)實(shí)驗(yàn)還有那些報(bào)告可參考：

前期回顧：

原位雜交檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告（一）

原位雜交檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告（二）

熒光原位雜交檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告（三）

原位雜交檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告（四）

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

用FISH技術(shù)檢測(cè)靶基因的定位情況。

二、實(shí)驗(yàn)原理

原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對(duì)特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過程。基本原理--堿基互補(bǔ)配對(duì)原理。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)論

DAPI染出來的細(xì)胞核在紫外的激發(fā)下為藍(lán)色，mRNA探針探針為紅色。

四、實(shí)驗(yàn)材料

1.主要儀器

2.主要試劑

一、實(shí)驗(yàn)步驟

試劑準(zhǔn)備:

1）lncRNAProbeMix儲(chǔ)存液（20μM），恢復(fù)至室溫。

2）U6，18S內(nèi)參探針儲(chǔ)存液（20μM），恢復(fù)至室溫。

3）預(yù)雜交液：將適量BlockingSolution與Pre-hybridizationBuffer按照1：99混勻后，37℃孵育至透明澄清狀態(tài)（約30min）后，分裝保存。在使用前，須在37℃氣浴或水浴中孵育至澄清透明。

4）雜交液：將適量BlockingSolution與HybridizationBuffer按照1：99混勻，37℃孵育30min后分裝保存。在使用前，須先在37℃氣浴或水浴中孵育30min。雜交液顏色偏黃屬于正?，F(xiàn)象。注：Pre-hybridizationBuffer（試劑A）和HybridizationBuffer（試劑B）從低溫取出時(shí)可能有沉淀析出，屬于正常現(xiàn)象。

5）將適量100XDAPI染色液（試劑D）與PBS按照1：99混勻，制備1XDAPI染色液。 

自備試劑：1）4%多聚甲醛2）通透液（含0.5%TritonX-100的PBS）3）1XPBS4）4XSSC5）雜交洗液I（4XSSC，0.1%Tween-20）6）雜交洗液II（2XSSC）7）雜交洗液III（1XSSC）8）封片劑。

FISH染色：

注：不同細(xì)胞系需根據(jù)其自身特性進(jìn)行優(yōu)化和調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件（固定、通透、雜交和洗脫），如在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)雜交效果不好或者背景太高，請(qǐng)適當(dāng)?shù)卣{(diào)整反應(yīng)時(shí)間與洗脫強(qiáng)度

1.細(xì)胞培養(yǎng)將細(xì)胞爬片置于24孔板孔底，培養(yǎng)適量細(xì)胞（～6X104/孔）。實(shí)驗(yàn)前使細(xì)胞融合度達(dá)到60%-70%。注：爬片與底板間不要產(chǎn)生氣泡。

2.細(xì)胞固定與通透a.【1XPBS】清洗細(xì)胞5min；b.【4%多聚甲醛】室溫固定10min；c.【1XPBS】清洗細(xì)胞5min，共3次；d.每孔加入1mL預(yù)冷的【通透液】，4°C靜置5min；e.棄去【通透液】后，加入【1XPBS】清洗細(xì)胞5min，3次。

3.探針檢測(cè)

a.每孔加入200uL【預(yù)雜交液】，37°C封閉30min；

b.預(yù)雜交同時(shí)，將【雜交液】在37°C中預(yù)熱；

c.避光條件下，把2.5uL20uM【lncRNAFISHProbeMix儲(chǔ)存液】或【內(nèi)參FISHProbeMix儲(chǔ)存液】加入到100μl【雜交液】中；注：探針濃度可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)情況進(jìn)行優(yōu)化。

d.棄去每孔細(xì)胞中的【預(yù)雜交液】，加入100uL含有探針的【探針雜交液】，避光，37°C雜交過夜；注：探針雜交液的用量具體依據(jù)細(xì)胞爬片待雜交區(qū)域優(yōu)化，只需保證細(xì)胞能充分接觸雜交液并且不出現(xiàn)干片的情況即可。

e.避光，42°C，【雜交洗液I】清洗每孔細(xì)胞3次，每次5min，以降低背景信號(hào)；

f.避光，42°C，【雜交洗液II】清洗細(xì)胞1次；g.避光，42°C，【雜交洗液III】清洗細(xì)胞1次；h.避光，【1XPBS】清洗細(xì)胞，室溫5min。注：所有指定溫度的步驟，注意將相關(guān)試劑預(yù)熱到對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)所需溫度后再使用。

4. 復(fù)染核：滴加DAPI避光孵育5min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，生理鹽水4次洗去多余的DAPI；

在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

 冰凍三尺，非一日之寒，普拉特澤致力于幫助廣大科研工作者解決學(xué)術(shù)寫作和發(fā)表中的各方面問題，不但授人以魚，亦授人以漁。