基因調(diào)取
原核生物的基因是連續(xù)不間隔的,直接用限制酶從DNA切取就可得到目的基因,再PCR擴(kuò)增后就能得到大量目的基因。 真核細(xì)胞核基因組DNA編碼的基因,以及感染真核細(xì)胞的DNA病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒基因組編碼基因,統(tǒng)稱(chēng)真核基因。真核基因調(diào)取是指通以動(dòng)物組織或細(xì)胞為模板,提取獲得cDNA或gDNA,從中擴(kuò)增基因或啟動(dòng)子等功能元件。也可將基因片段或者各功能元件片段亞克隆至各載體。
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實(shí)驗(yàn)介紹
【技術(shù)原理】
原核生物的基因是連續(xù)不間隔的,直接用限制酶從DNA切取就可得到目的基因,再PCR擴(kuò)增后就能得到大量目的基因。
真核細(xì)胞核基因組DNA編碼的基因,以及感染真核細(xì)胞的DNA病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒基因組編碼基因,統(tǒng)稱(chēng)真核基因。真核基因調(diào)取是指通以動(dòng)物組織或細(xì)胞為模板,提取獲得cDNA或gDNA,從中擴(kuò)增基因或啟動(dòng)子等功能元件。也可將基因片段或者各功能元件片段亞克隆至各載體。
【原核流程】
【真核流程】
案例展示
臨床組織樣本的目的基因調(diào)取
送檢與交付標(biāo)準(zhǔn)
樣品類(lèi)型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運(yùn)輸條件 | 備注 |
---|---|---|---|---|
動(dòng)物組織 | 單個(gè)樣品>0.1g,2mlEP管或凍存管裝,不要過(guò)量;樣本應(yīng)盡量新鮮,如不能立即提取蛋白或核酸,應(yīng)液氮速凍后凍存于-80℃或更低,凍存樣本避免反復(fù)凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記,且標(biāo)記清晰可識(shí) |
種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本,單個(gè)樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
貼壁/懸浮細(xì)胞 | 1. 總RNA或蛋白:106cell/指標(biāo)、漿/核RNA或蛋白:107cell/指標(biāo)、線粒體RNA或蛋白:2*107 cell/指標(biāo),樣本盡量新鮮,細(xì)胞收取后直接加Trizol(QPCR檢測(cè))或直接凍存于-80℃ 2. 若細(xì)胞處理(加藥、轉(zhuǎn)染、感染)后狀態(tài)差應(yīng)酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml,骨髓 1~3ml; -80℃保存不超半周的白細(xì)胞勻漿>400μl,每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
石蠟包埋樣品 | 由標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊,有效厚度大于 0.1cm; 新鮮的 FFPE 組織切片,每片厚度不超過(guò) 10μm,2~8 張,表面積不超過(guò) 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿(mǎn)足相應(yīng)實(shí)驗(yàn)要求的抗體; 2. 按抗體說(shuō)明書(shū)要求寄送,盡量避免分裝;如分裝,確保量足夠進(jìn)行實(shí)驗(yàn),并提供抗體說(shuō)明書(shū)。 3.保存抗體的抗體管上應(yīng)有能夠識(shí)別此抗體的標(biāo)記,抗體的量應(yīng)大于實(shí)驗(yàn)所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
引物 | 干粉,≥1OD,如進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),每個(gè)基因至少提供兩對(duì)引物, 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |