雙熒光素酶報(bào)告測(cè)定的方法
來(lái)源/作者:普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺(tái)
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雙熒光素酶測(cè)定法,用于檢測(cè)基因調(diào)控、信號(hào)通路和藥物篩選等方面的研究。該方法通過(guò)測(cè)定熒光素酶的熒光強(qiáng)度,反映了基因的表達(dá)水平或信號(hào)通路的活性。
以下是雙熒光素酶報(bào)告測(cè)定法的一般步驟:
1.構(gòu)建表達(dá)雙熒光素酶的質(zhì)粒:在質(zhì)粒中克隆想要研究的基因的啟動(dòng)子區(qū)域(或者其他感興趣的區(qū)域),并將雙熒光素酶基因放在該啟動(dòng)子區(qū)域下游,形成表達(dá)雙熒光素酶的質(zhì)粒。
2.轉(zhuǎn)染質(zhì)粒:將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到目標(biāo)細(xì)胞中,使其表達(dá)雙熒光素酶。
3.處理樣本:根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要,處理細(xì)胞樣本,如添加藥物、激素等。
4.添加底物:將Luciferin底物加入到樣本中,Luciferin是一種可以被熒光素酶催化分解的化合物,分解后會(huì)放出熒光。
5.測(cè)定熒光:使用熒光儀測(cè)定Luciferin分解后放出的熒光強(qiáng)度,該熒光強(qiáng)度反映了雙熒光素酶的活性。同時(shí),也可以在熒光素酶的另一端接入Renilla熒光素酶,用來(lái)進(jìn)行內(nèi)部對(duì)照,來(lái)排除細(xì)胞數(shù)量和轉(zhuǎn)染效率的影響。
6.計(jì)算結(jié)果:根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要,計(jì)算樣本中Luciferin分解的熒光強(qiáng)度,比較各樣本之間的差異,來(lái)推斷基因表達(dá)水平或信號(hào)通路活性等。
需要注意的是,每個(gè)實(shí)驗(yàn)具體步驟可能有所不同,具體實(shí)驗(yàn)條件需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行調(diào)整。
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