酵母雙雜交常見問題及解決方法下【酵母雙雜外包】
2022-09-16 14:10:21
來源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺(tái)
酵母雙雜實(shí)驗(yàn)常見問題及解決方法下篇由普拉特澤生物技術(shù)為大家總結(jié)分享。本文是關(guān)于酵母雙雜實(shí)驗(yàn)的最后一篇介紹，前面我們學(xué)習(xí)了什么是酵母雙雜、酵母雙雜實(shí)驗(yàn)操作步驟、酵母雙雜注意事項(xiàng)以及酵母雙雜實(shí)操常見問題及處理的上篇，可以點(diǎn)擊標(biāo)題直接傳送回去學(xué)習(xí)的哦。普拉特澤生物分子檢測(cè)平臺(tái)承接酵母雙雜實(shí)驗(yàn)外包上百例，早就為大家把實(shí)驗(yàn)過程中要踩的雷、吃的虧幫大家吃完了，現(xiàn)在我們就來看看，實(shí)驗(yàn)過程中還有哪些常見的問題和解決方法吧！
前期回顧：
什么是酵母雙雜？
酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)詳細(xì)操作步驟
酵母雙雜實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)
酵母雙雜實(shí)驗(yàn)常見問題及處理（上）
問題一：.酵母轉(zhuǎn)化完成后可以用無菌水代替0.9%氯化鈉溶液重懸菌體嗎？
可以的，生理鹽水重懸的目的是為了維持滲透壓，無菌水重懸酵母菌也可以，無菌水重懸后涂板和生理鹽水重懸后涂板，轉(zhuǎn)化效率并無明顯差異。
問題二：如何降低酵母雙雜交系統(tǒng)中出現(xiàn)的假陽性？
可以選擇多個(gè)篩選標(biāo)記進(jìn)行更為嚴(yán)格的篩選，降低假陽性。
問題三：誘餌蛋白是否一定需要自激活檢測(cè)？
不一定，自激活檢測(cè)需要在Y2H Gold菌株中進(jìn)行。主要作用有兩個(gè)，其一，需要根據(jù)誘餌蛋白自激活的程度調(diào)整AbA的濃度或3-AT的濃度；其二，檢測(cè)誘餌蛋白是否具有毒性，如果菌落生長(zhǎng)過慢，可能表達(dá)的蛋白具有毒性，需要使用低拷貝的質(zhì)粒表達(dá)誘餌蛋白。
問題四：AbA濃度對(duì)酵母菌篩選有什么影響？
AbA用于篩選陽性克隆，雙雜常用濃度為100-200 ng/mL 。在陰性、陽性對(duì)照正常的前提下，如果篩選出來的陽性克隆數(shù)太少，可以將AbA濃度降至100ng/mL；如果篩選出來的陽性克隆數(shù)太多，排除自激活的前提下，相應(yīng)增加AbA的濃度。AbA的有效濃度也與接種量有關(guān)，如因接種量過多在含AbA的平板長(zhǎng)出連成片的菌落，使得AbA無法達(dá)到有效作用效果。
問題五：3-AT的篩選濃度怎么選擇，有沒有建議的使用濃度范圍？
理想情況 10 mM濃度的3-AT平板會(huì)有少量生長(zhǎng)，20 mM濃度的3-AT不能或極少生長(zhǎng)。如果在80 mM濃度的3-AT平板上生長(zhǎng)酵母，說明自激活活性太高，不能用于雙雜交篩選。
問題六：誘餌蛋白具有自激活活性，能夠單獨(dú)激活報(bào)告基因的表達(dá)怎么辦？
該蛋白如果是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，具有轉(zhuǎn)錄激活域，需要去掉轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。如果不是轉(zhuǎn)錄因子但仍具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活活性，需要將誘餌蛋白具有激活活性的區(qū)域去除，進(jìn)行后續(xù)操作，但這樣操作有可能影響蛋白間的互作。
問題七：誘餌蛋白的大小是否對(duì)酵母雙雜交的結(jié)果有影響？
雖然文獻(xiàn)報(bào)道從8-750個(gè)氨基酸都有成功的案例，但是分子量比較大的蛋白由于在酵母中可能存在折疊錯(cuò)誤的情況，在實(shí)際工作中，分子量比較大的誘餌蛋白在酵母中尋找互作蛋白的成功率低于中等大小分子量的誘餌蛋白。
問題八：酵母雙雜交如何選擇使用核體系還是膜體系文庫(kù)？
如果誘餌蛋白定位在膜上，使用膜體系文庫(kù)；如果誘餌蛋白定位在細(xì)胞核則選擇核體系；如果誘餌蛋白具有跨膜區(qū)，可以考慮把跨膜區(qū)去除或者選用定位在胞內(nèi)的區(qū)域使用核體系進(jìn)行篩庫(kù)，但有一定風(fēng)險(xiǎn)。
問題九：在酵母菌株中檢測(cè)不到誘餌蛋白的表達(dá)或者表達(dá)不完全，怎么辦？
可能是酵母細(xì)胞的OD值太低，細(xì)胞數(shù)量少，導(dǎo)致誘餌蛋白量低，很難檢測(cè)到，可以增加液體培養(yǎng)量；另一種原因可能是誘餌蛋白包含大量的稀有密碼子，酵母很難進(jìn)行翻譯，建議優(yōu)化氨基酸序列，合成一條由酵母細(xì)胞能夠識(shí)別的密碼子組成的編碼相同的氨基酸序列的核苷酸，有望大大提高誘餌蛋白在酵母細(xì)胞中的表達(dá)。
問題十：四缺板上篩選到的陽性克隆可以直接拿菌液或酵母質(zhì)粒去測(cè)序嗎？
不行，因?yàn)榻湍纲|(zhì)?？截悢?shù)低，達(dá)不到測(cè)序濃度，所以需要將抽提出的質(zhì)粒轉(zhuǎn)到大腸桿菌培養(yǎng)后再測(cè)序。
好啦，那關(guān)于酵母雙雜實(shí)驗(yàn)的所有常見問題和解決方法我們就介紹完啦，如果您也對(duì)酵母雙雜感興趣準(zhǔn)備做這個(gè)實(shí)驗(yàn)，可以參考咱們關(guān)于酵母雙雜實(shí)驗(yàn)的介紹、步驟、注意事項(xiàng)與常見問題參考設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案哦，還有不懂的可以直接給客服留言，我們會(huì)在第一時(shí)間給到您回復(fù)的哦！
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