酵母雙雜交常見問題及解決方法上【酵母雙雜外包】
2022-09-16 13:58:45
來源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學整體課題外包平臺
大家好，今天普拉特澤生物跟大家一起學習的是酵母雙雜實驗的常見問題及解決方法上篇，酵母雙雜交實驗作為普拉特澤生物分子檢測平臺的常規(guī)實驗，在上百例酵母雙雜實驗外包中，積累了大量的實操經(jīng)驗。酵母雙雜交實驗過程有時遇到非常多的問題，本文就把這些實驗的常見問題解決方法分享給大家！
問題一：滅菌后酵母培養(yǎng)基顏色變成棕褐色怎么辦？
SD系列的培養(yǎng)基預混了葡萄糖，在滅菌過程中由于滅菌時間較長，或者滅菌后在高溫條件下長時間放置，引起培養(yǎng)基中葡萄糖碳化，導致顏色變深。通常情況下，對酵母培養(yǎng)不會產生較大影響（對個別畢赤酵母菌種影響較大），可以通過控制滅菌時間和滅菌溫度來減少碳化程度，如118℃滅菌15分鐘，并及時倒板。另外Coolaber產品中SC系列酵母培養(yǎng)基，不包含葡萄糖，需要將過濾除菌的葡萄糖加入滅菌后的酵母培養(yǎng)基中，這種方法配制的培養(yǎng)基，呈現(xiàn)透明偏白色。
問題二： 酵母培養(yǎng)基不凝膠，或者凝膠硬度不夠怎么辦？
調整酵母篩選培養(yǎng)基的pH（5.8）; 適當增加瓊脂（建議量20g/L）。2019年后Coolaber公司出品的酵母培養(yǎng)基，只需要加入適量的去離子水，無需調pH，直接滅菌即可。
問題三：培養(yǎng)過程中酵母細胞變成粉色的可能原因。
培養(yǎng)基中腺嘌呤（Ade）濃度低；或酵母細胞代謝途徑產生問題。一般通過往培養(yǎng)基中補加硫酸腺嘌呤（60mg/L）來改善這一情況。Coolaber所有酵母培養(yǎng)基均加入足夠的腺嘌呤。實際操作中，酵母變粉色也并不影響蛋白間的相互作用。
問題四：酵母細胞生長慢怎么辦？
可能原因：酵母表達的誘餌蛋白對細胞有毒害作用，影響酵母生長。
解決辦法：可通過選擇低敏感性的酵母菌株；或選用低拷貝數(shù)的表達載體。
問題五：誘餌蛋白對酵母細胞是有毒的，該怎樣進行后續(xù)實驗？
在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)不好的菌株可以在固體培養(yǎng)基上生長得很好。首先重懸克隆于1mL的SD/–Trp（PM2251），接著將重懸液平鋪于5 個100mm的SD/–Trp平板（PM2252），在30℃下溫浴，直至平板上的克隆相互連在一起。用5mL 0.5X YPDA（PM2011）刮下每塊板上的克隆，并收集到一管中，這樣就可以使用這個細胞重懸液進行正常的雜交反應。
問題六：篩選培養(yǎng)基上克隆太多怎么辦？
可能原因：可能誘餌蛋白存在自激活，自身就可以激活下游篩選標記的表達；或者是篩選條件過于寬松。
解決辦法：選用更為嚴格的篩選條件抑制誘餌蛋白的自激活活性，如果效果不理想，可以刪除誘餌蛋白能夠引起自激活活性的結構域，再用于酵母雙雜交實驗。
問題七：篩選培養(yǎng)基上克隆太少怎么辦？
可能原因：酵母雜交效率低；或篩選條件太嚴格
解決辦法：延長雜交時間，提高雜交效率；放寬篩選條件。
問題八：酵母質粒提取比較繁瑣，有沒有好的替代方法？
Coolaber出品的酵母陽性克隆快速鑒定試劑盒（SK2420）僅僅需要高溫加熱酶解酵母菌3-5分鐘就可以獲取酵母質粒粗提物，完全可以用于PCR驗證。
問題九：獲得的陽性克隆，PCR檢測有多條片段。
可能原因：一個酵母細胞可以包含多個捕獲蛋白。
解決辦法：選取單克隆劃板2-3次，進行藍白斑篩選，直到?jīng)]有分離，找到陽性克隆，用于后續(xù)實驗。
問題十：雜交效率不高，怎么辦？
效率不高，可能是雜交細胞數(shù)量不夠，可以適當增加誘餌蛋白的液體培養(yǎng)量，保證有足夠的細胞數(shù)量。也可以延長雜交時間，直至通過顯微鏡鏡檢觀察到存在三葉草形狀的合子產生，再進行后續(xù)操作。
好啦，那關于酵母雙雜交實驗的常見問題上篇咱們就介紹到這里啦，如果沒有您遇到過的問題可以看一看《酵母雙雜實驗常見問題下篇》，或者直接留言給客服，技術會一對一詳細技術答疑的哦。如果您有酵母雙雜實驗外包的需求，請認準——普拉特澤生物！
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