Western blot檢測實驗常見問題原因及解決方法（中）
2022-03-02 13:05:03
來源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學整體課題外包平臺
Western blot（蛋白質(zhì)免疫印跡）實驗操作常見問題原因及由普拉特澤生物旗下生物科研培訓品牌《春風學院》總結分享，普拉特澤生物提供線下WB實驗外包與實驗理論實操的線上下培訓，實驗真、周期短、人才廣、技術高！
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常見問題一、Western blot實驗結果中雜帶較多
原因1： 目的蛋白有多個修飾位點，如磷酸化位點、糖基化位點、乙酰化位點等，本身可以呈現(xiàn)多條帶；
解決方法：WB實驗前查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白實際大小。
原因2：實驗檢測的目的蛋白有其它剪切本；
解決方法：查閱文獻或生物信息學分析可能性。
原因3：樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解；
解決方法：WB檢測的蛋白樣本加入蛋白酶抑制劑同時樣本處理時在冰上操作。
原因4：上樣量過高，太敏感；
解決方法：盡量減少上樣量，注意觀察。
原因5：一抗不純或特異性不高；
解決方法：純化抗體，或者重新選擇或制備高特異性的抗體。
原因6：一抗或者二抗?jié)舛绕撸?/span>
解決方法：降低一抗、二抗?jié)舛取?br/>
常見問題二、Western blot實驗結果中條帶大小與理論值位置不符
原因1：Marker指示大小偏差；
解決方法：WB實驗中選擇合適的預染Marker，并與非預染Marker 對比，觀察差異大小。
原因2：瓊脂糖凝膠電泳體系影響；
解決方法：避免邊緣孔的不穩(wěn)定因素，在中間孔上樣，邊緣孔加入等量上樣緩沖液平衡體系。
原因3：翻譯后修飾；
解決方法：查閱文獻，確認蛋白本身是否存在磷酸化或糖基化等修飾。
原因4：翻譯后剪切及異構體；
解決方法：查閱文獻，確認蛋白是否存在多種剪切活性形式。
原因5：蛋白多聚體形成；
解決方法：蛋白二聚體或多聚體形成，在樣本制備過程中，使用新鮮的DTT或β-巰基乙醇，保持蛋白單體狀態(tài)。
原因6：蛋白相對電荷變化；
解決方法：蛋白氨基酸組成不同，某些蛋白所帶電荷未能被帶負電的SDS所覆蓋，導致蛋白遷移率與蛋白大小不成正比。
OK，Western blot實驗常見問題原因以及解決方法中篇就我們就總結完咯，禿頭小寶貝們學會了嗎？希望能幫到在實驗室埋頭苦干的實驗人員，想要詳細學習實驗操作方法的好學者們可點擊《Western Blot實驗理論+實操》觀看學習哦！
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