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Western blot檢測_蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)步驟及視頻教程

2022-02-18 16:08:31

來源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺

本文由普拉特澤生物旗下生物科研培訓(xùn)品牌《春風(fēng)學(xué)院》分享，春風(fēng)學(xué)院提供線上視頻課程培訓(xùn)，線下實(shí)操一對一帶教，是你快速掌實(shí)驗(yàn)技能的好幫手哦，關(guān)于Western blot檢測詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟及實(shí)驗(yàn)干貨輸送，篇尾有視頻教程方便大家理解


   Western blot檢測實(shí)驗(yàn)是科研造假的重災(zāi)區(qū)，WB檢測其操作上手難度也名列前茅，就連大部分實(shí)驗(yàn)老手也飽受折磨，所以想要獲得一張漂亮的WB結(jié)果非常不容易。


 相信每個做WB（蛋白質(zhì)免疫印跡）實(shí)驗(yàn)的高手都有一些自己的獨(dú)門經(jīng)驗(yàn)，而普拉特澤生物做為依托互聯(lián)網(wǎng)從事線上實(shí)驗(yàn)服務(wù)外包服務(wù)，并面向全國承接實(shí)驗(yàn)外包的生物科研公司，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的WB檢測也承接了數(shù)以千記的的WB實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，積累了大量的WB檢測案例，為廣告科研工作者提供實(shí)驗(yàn)步驟的教學(xué)與培訓(xùn)服務(wù)。



   好了廢話不多說上正菜!WB檢測實(shí)驗(yàn)步驟:
   WB檢測第一步：準(zhǔn)備蛋白樣本
   （1）首先在顯微鏡下觀察確保收集健康的、按預(yù)期生長的wb檢測的細(xì)胞樣本。

   （2）倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液；或者將瓶直立放置一會兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走。
   （3）每瓶細(xì)胞加3 mL 4℃預(yù)冷的PBS。平放輕輕搖動一分鐘洗滌準(zhǔn)備wb檢測的細(xì)胞樣本，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，清洗洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。方便后續(xù)細(xì)胞裂解操作，詳細(xì)實(shí)驗(yàn)操作演示可在wb視頻教程觀看討論哦。
   （4）根據(jù)普拉特澤多例western blot實(shí)操的經(jīng)驗(yàn)，裂解液與PMSF最優(yōu)配比為1毫升裂解液加10微升 PMSF（100 mM），輕輕地將其搖至均勻無結(jié)晶放置于冰上。
   （5）每瓶細(xì)胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動。
   （6）wb待測細(xì)胞裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 mL離心管中。（整個操作盡量在冰上進(jìn)行）
   （7）提前開離心機(jī)預(yù)冷后于4℃下12000 rpm離心5 min。
   （8）將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5 mL的離心管中放于－20℃保存。所有蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)操中，蛋白樣本的制備基本都是最重要的步驟，好的蛋白樣本對wb實(shí)驗(yàn)操作后期的凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜都是舉足輕重的。

 
  WB檢測第二步：SDS-PAGE凝膠電泳   

   (1) 清洗玻璃板：一只手扣緊玻璃板，另一只手用無塵布輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后晾干。未徹底清潔干凈容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)印跡跑膠痕跡不清晰，wb實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析造成困擾。

   (2) 組裝制膠器：玻璃板對齊后放入夾中卡緊，加滿純水或蒸餾水進(jìn)行試漏，5 min左右液面不下降即可。

   (3) 配制分離膠：根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量來確定分離膠的濃度。目標(biāo)蛋白的分子量越小，丙烯酰胺/bis 的百分比越高。目標(biāo)蛋白的分子量越大，丙烯酰胺/bis 的百分比越低。按配5%分離膠為例，按下表比例配制好膠液，動作盡量迅速。特別注意，TEMED起凝膠作用，所以待一切都準(zhǔn)備就續(xù)再最后加入TEMED，混勻后立即灌膠。灌膠時(shí)，可用10 mL移液器吸取，沿內(nèi)側(cè)玻璃壁緩慢放出，1.5 mm厚的玻璃板灌膠約6-7mL左右。最后在分離膠上加1 mL 75%酒精。

western blot實(shí)驗(yàn) 分離膠的配方

     

   （4） 配制濃縮膠：同樣以配制5％的濃縮膠為例。待分離膠凝固，倒出封液的酒精。按配方配制分離膠，同樣注意最后加入TEMED，而后混勻（不要劇烈搖晃，避免產(chǎn)生氣泡）即可灌膠。將板中剩余空間灌滿濃縮膠后將梳子插入濃縮膠中。插梳子時(shí)從一側(cè)傾斜插入，最后使梳子保持水平（避免梳子底下有氣泡）。灌膠時(shí)也要沿玻璃板緩慢流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。

western blot實(shí)驗(yàn) 5%濃縮膠的配方


   （5） 上樣：加足夠的電泳緩沖液后開始準(zhǔn)備上樣(電泳緩沖液至少要漫過內(nèi)側(cè)的小玻璃板)。然后平穩(wěn)拔出梳子，速度不宜過快，避免加樣孔變形。盡量保證每個加樣孔的形狀一致（可用鑷子將膠撥正）。用10μl移液槍吸取7-10μl樣品緩慢加入加樣孔中（每孔樣品量保持一致，避免條帶長短不一），根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要在未加樣的任意孔加3μl蛋白marker或同體積的1×Loading buffer。

   （6） 電泳：電泳時(shí)電壓為80V，當(dāng)marker進(jìn)入分離膠（可看到不同顏色的marker條帶時(shí)），可將電壓調(diào)整至120V，電泳至溴酚藍(lán)跑至膠底即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。
 

                    


    WB檢測第三步轉(zhuǎn)膜：

   （1）轉(zhuǎn)膜需準(zhǔn)備適量濾紙和1張與膠同等大小的PVDF膜。PVDF膜大小需要根據(jù)膠的大小來裁剪，在裁剪時(shí)注意不要用收直接接觸PVDF膜。切好的PVDF膜還需于甲醇中浸泡10s，再于轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5min后使用；

   （2）在倒有轉(zhuǎn)膜液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子，夾子每邊各墊一層海綿墊及適量濾紙（轉(zhuǎn)膜液的量宜沒過夾子）。

   （3）用切膠尺撬開玻璃板，撬的時(shí)候動作要輕。切去非目的蛋白部分，小心剝下分離膠放置在夾子黑色面，用手或切膠板調(diào)整使其與濾紙對齊，輕壓搟去氣泡。將適宜大小的膜覆蓋在膠上搟去氣泡。在膜上蓋濾紙并除去氣泡。將夾子另一面蓋上并夾緊，放入轉(zhuǎn)膜槽，夾子黑色面對槽的黑面，夾子白色面對槽的紅面。整個操作在轉(zhuǎn)膜緩沖液中進(jìn)行，操作時(shí)盡量避免膠與膜之間有氣泡（轉(zhuǎn)膜液含甲醇，操作時(shí)要戴手套，實(shí)驗(yàn)室要開門以使空氣流通）。
    

                                        


WB檢測第四步 免疫反應(yīng)：

   （1）封閉：將膜移至含有5%脫脂牛奶粉（1×PBST溶解奶粉）封閉液的孵育盒中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1h左右

   （2）一抗孵育：將一抗用5%BSA稀釋至適當(dāng)濃度（根據(jù)抗體說明書調(diào)整抗體稀釋比）。從封閉液中取出膜，用PBST或水洗去殘留封閉液。將膜放入新的孵育盒，加入稀釋后的一抗，置于4℃冰箱孵育過夜或室溫?fù)u床孵育1h以上，孵育結(jié)束后，用PBST洗膜。

   （3）將二抗用PBST稀釋至適當(dāng)濃度（根據(jù)抗體說明書調(diào)整抗體稀釋比），室溫下孵育1h后（或者37℃恒溫箱孵育10-15min），用PBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5-10min。
     

WB檢測第五步化學(xué)發(fā)光：  

   （1）根據(jù)wb檢測試劑盒說明書，配制顯影液。
   （2）將孵育完成的膜用鑷子將其平鋪在平板上，移液槍吸取發(fā)光底物，均勻覆蓋膜。  

   （3）將平板放入顯影儀。

                         


   最后就是進(jìn)行整個western blot（蛋白質(zhì)免疫印跡）實(shí)驗(yàn)結(jié)果的拍照與總結(jié)分析啦，回顧整個實(shí)驗(yàn)過程，詳細(xì)步驟其實(shí)就是：提取細(xì)胞蛋白、BCA定量、制備蛋白膠、蛋白樣本變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗、二抗、顯影、結(jié)果分析。
   是不是很簡單呢？wb檢測的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟如果您還有實(shí)驗(yàn)過程中的疑問可以關(guān)注咱們的春風(fēng)學(xué)院——western blot（理論+實(shí)操）篇，或報(bào)名進(jìn)行線下一對一wb檢測培訓(xùn)，分WB檢測理論分析和WB實(shí)驗(yàn)操作演示，進(jìn)行系統(tǒng)性的學(xué)習(xí)實(shí)際操作與結(jié)果分析哦。

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