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   雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)操作注意事項(xiàng)由普拉特澤生物分子檢測平臺與《春風(fēng)學(xué)院》給大家總結(jié)分享，文尾附上視頻教程供大家學(xué)習(xí)。《春風(fēng)學(xué)院》為普拉特澤生物旗下唯一的科研培訓(xùn)品牌，為廣大科研人員提供線上下6大國自然專題精講、15項(xiàng)常用實(shí)驗(yàn)技能講解與實(shí)操培訓(xùn)課程。同時，普拉特澤生物更承接線下雙熒光素酶報(bào)告基因檢測等各類生物實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)，鋪平你的科研路~

   好了話不多說我們詳細(xì)看看，雙熒光素酶檢測實(shí)操過程中有哪些注意事項(xiàng)！

   1、報(bào)告基因檢測受多種因素影響(載體狀態(tài)細(xì)胞狀態(tài)、轉(zhuǎn)染量、轉(zhuǎn)染效率、裂解效率、加樣精度、檢測過程等)，因此同批次樣品檢測值也可能出現(xiàn)浮動。所以實(shí)驗(yàn)一般需要做3個或者3個以上復(fù)孔，并且引入另一個報(bào)告基因作為內(nèi)參。

   2、細(xì)胞培養(yǎng)時間不宜過長，12-36h內(nèi)最好;長時間培養(yǎng)后，細(xì)胞難裂解。

   3、雙熒光素酶報(bào)告基因的載體選擇：

   （1）螢火蟲熒光素酶建議選取pGL-3或pGL-4的載體或自己構(gòu)建相應(yīng)的載體;

   （2）海腎熒光素酶建議選取phRL-TK或pGL-4代載體或自己構(gòu)建相應(yīng)的載體。建議海腎載體不使用強(qiáng)啟動子(如SV40、CMV)，而選用中等強(qiáng)度的啟動子(如TK)。

   4、雙熒光素酶報(bào)告基因的載體比例:根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體情況調(diào)整。建議作一個預(yù)實(shí)驗(yàn)來調(diào)整(董火蟲載體與海腎載體比例分別用1:101:201:501:100)，黃火蟲熒光素酶檢測發(fā)光值大于海腎

熒光素酶發(fā)光值的比例較好。

   5、最適反應(yīng)溫度室溫(20-22℃)。各個組分(細(xì)胞裂解產(chǎn)物，底物工作液等)都需要調(diào)整到室溫。

   6、雙熒光素酶反應(yīng)體積:20uL(細(xì)胞裂解產(chǎn)物)-100uL(黃火蟲熒光素酶底物)-100uL(海腎熒光素酶底物)，底物量可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整，但一定要保證底物過量，不然會造成檢測結(jié)果出現(xiàn)大的偏差。

   7、細(xì)胞裂解產(chǎn)物存放：常溫不超過6小時；-20℃一個月；-80℃半年

   8、裂解產(chǎn)物與底物混合(手動加樣):要求混合快速、混合時間一致，避免熒光素酶衰變的影響。

   9、發(fā)光半衰期：

   （1）單熒光素酶檢測試劑盒(E1500)，螢火蟲熒光素酶的發(fā)光半衰期約12 min

   （2）雙熒光素酶檢測試劑盒(E1910)，黃火蟲熒光素酶的發(fā)光半衰期約9 min，海腎熒光素酶的發(fā)光半衰期約2 min

   10、檢測結(jié)果：

   檢測前應(yīng)檢測引板或空管的發(fā)光值，作為儀器發(fā)光背景值，Modulus多功能檢測儀的儀器背景值應(yīng)小于100；樣品檢測發(fā)光值應(yīng)該遠(yuǎn)大于儀器背景值，例如10000。如果樣品發(fā)光值過于接近儀器背景值，說明樣品中熒光素酶過少，需要考慮轉(zhuǎn)染量、轉(zhuǎn)染效率、裂解效率等因素。

         好啦，關(guān)于雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)我們就講完啦，還有不懂的同學(xué)歡迎隨時留言哦，需要視頻教程的同學(xué)請點(diǎn)擊：《雙熒光素酶原理+實(shí)操》