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   一、樣品準(zhǔn)備

   1、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞

（1）細(xì)胞鋪板:將細(xì)胞按50%的密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)12孔板內(nèi)。

（2）轉(zhuǎn)染:16h左右細(xì)胞約70%時(shí)轉(zhuǎn)染黃光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。首先設(shè)計(jì)四組:

空白組（轉(zhuǎn)染試劑+細(xì)胞）

質(zhì)粒組

質(zhì)粒+miRNA NC組

質(zhì)粒+miRNA mimics組
    2、其他準(zhǔn)備工作

（1）配制質(zhì)粒組:按照每空50ng質(zhì)粒，同時(shí)每孔20ul無(wú)血清培養(yǎng)基計(jì)算需用量，標(biāo)記為A。

（2）配制miRNANC/mimics:miRNANC/mimics的終濃度為20 nM，同時(shí)每孔20ul無(wú)血清培養(yǎng)基計(jì)算需用量，分別標(biāo)記為B、C。

（3）配制對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)染試劑:按照每孔05ulL轉(zhuǎn)染試劑同時(shí)每孔20uL無(wú)血清培養(yǎng)基計(jì)算需用量，標(biāo)記為D。稀釋好的四組試劑常溫孵育5 min。

（4）將稀釋好的質(zhì)粒DNA和miRNAmimics分別和對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)染試劑混勻，常溫孵育20 min。

（5）將上一步中試劑對(duì)應(yīng)加入孔中。

（6）轉(zhuǎn)染6h后，換新鮮完全培養(yǎng)基。

   二、雙報(bào)告基因檢測(cè)

（1）質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染36-48h后，棄去培養(yǎng)基，用100uL1XPBS清洗細(xì)胞。

（2）傾斜12孔板，吸干剩余的PBS。

（3）離子水將5XPLB(裂解液)稀釋成1XPLB(現(xiàn)配現(xiàn)用)，使用前放到常溫。

（4）每孔加50uL稀釋好的1XPLB，置搖床振搖20-30 min以保證裂解緩沖液完全裂解細(xì)胞。

（5）選用白色不透光的96孔酶標(biāo)板中每孔加步驟4的上清液10uL，加入100uL預(yù)先混好的 Luciferase Assay ReagentII，2s后測(cè)數(shù)據(jù)，檢測(cè)熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度。注意此步需在避光條件下進(jìn)行。

（6）測(cè)定結(jié)束后，每孔添加100uL預(yù)先混好的Stop&Glo Reagent，靜止2s后，測(cè)數(shù)據(jù)，檢測(cè)內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度。

（7）記錄讀數(shù):每個(gè)樣品會(huì)有3個(gè)數(shù)值:RLU1-黃火蟲熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度RLU2-內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度計(jì)算兩組數(shù)據(jù)比值，即RLU1/RLU2。

（8）分析數(shù)據(jù):比較1、2組可以發(fā)現(xiàn)由于對(duì)照組未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，因此檢測(cè)不到熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度。比較3.4組，由干轉(zhuǎn)染microRNAmimics進(jìn)行microRNA的過(guò)表達(dá)，黃光素酶的活性降低，提示microRNA可能參與抑制靶基因的表達(dá)，需要結(jié)合定點(diǎn)突變等方法進(jìn)一步確定 miRNA與靶基因3UTR的作用位點(diǎn)。

   好的，那么雙熒光素酶檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)操作步驟我們就分享完啦，還沒(méi)有學(xué)會(huì)的同學(xué)可以點(diǎn)擊：《雙熒光素酶原理+實(shí)操》觀看視頻教程學(xué)習(xí)哦。