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什么是酵母雙雜系統(tǒng)？【酵母雙雜外包】

2022-09-08 17:53:33

來(lái)源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺(tái)

        今天普拉特澤生物跟大家一起學(xué)習(xí)一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)——酵母雙雜交系統(tǒng)。酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast two-hybrid system）的建立是基于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程的認(rèn)識(shí)。普拉特澤生物——分子檢測(cè)平臺(tái)長(zhǎng)期承接酵母雙雜實(shí)驗(yàn)代做，今天就來(lái)跟大家一起簡(jiǎn)單學(xué)習(xí)一下什么是酵母雙雜系統(tǒng)。

        酵母雙雜交系統(tǒng)是將待研究的兩種蛋白質(zhì)分別克隆（融合）到酵母表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活因子（如GAL4等）的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-BD）和轉(zhuǎn)錄激活域（AD）上，構(gòu)建成融合表達(dá)載體，從表達(dá)產(chǎn)物分析兩種蛋白質(zhì)相互作用的系統(tǒng)。

        雙雜交系統(tǒng)的建立得力于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程的認(rèn)識(shí)。細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。80年代的工作表明，轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的（modular），即這些因子往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain，簡(jiǎn)稱為BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain，簡(jiǎn)稱為AD），它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。單獨(dú)的BD雖然能和啟動(dòng)子結(jié)合，但是不能激活轉(zhuǎn)錄。而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的BD和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。如酵母細(xì)胞的Gal4蛋白的BD與大腸桿菌的一個(gè)酸性激活結(jié)構(gòu)域B42融合得到的雜合蛋白仍然可結(jié)合到Gal4結(jié)合位點(diǎn)并激活轉(zhuǎn)錄。

        Fields等人的工作標(biāo)志著雙雜交系統(tǒng)的正式建立。他們以與調(diào)控SUC2基因有關(guān)的兩個(gè)蛋白質(zhì)Snf1和Snf2為模型，將前者與Gal4的BD結(jié)構(gòu)域融合，另外一個(gè)與Gal4的AD結(jié)構(gòu)域的酸性區(qū)域融合，由BD和AD形成的融合蛋白一般分別稱之為“誘餌”（bait）和“獵物”或靶蛋白（prey or target protein）。發(fā)展起來(lái)的各種雙雜交系統(tǒng)大多是以Fields等人建立的系統(tǒng)為基礎(chǔ)的。

        在雙雜交鑒定過(guò)程中要經(jīng)過(guò)兩次轉(zhuǎn)化，這個(gè)工作量是相當(dāng)大的，特別是尋找新的作用蛋白質(zhì)的時(shí)候尤其如此。Bendixen等人通過(guò)酵母接合型的引用，避免了兩次轉(zhuǎn)化操作，同時(shí)又提高了雙雜交的效率。在酵母的有性生殖過(guò)程中涉及到兩種配合類型：a接合型和α接合型，這兩種單倍體之間接合（mating）能形成二倍體，但a接合型細(xì)胞之間或α接合型細(xì)胞之間不能接合形成二倍體。

        酵母雙雜交系統(tǒng)能在體內(nèi)測(cè)定蛋白質(zhì)的結(jié)合作用，具有高度敏感性。

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        ①采用高拷貝和強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)載體使雜合蛋白過(guò)量表達(dá)。

        ②信號(hào)測(cè)定是在自然平衡濃度條件下進(jìn)行，而如免疫共沉淀等物理方法為達(dá)到此條件需進(jìn)行多次洗滌，降低了信號(hào)強(qiáng)度。

        ③雜交蛋白間穩(wěn)定性可被激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物而增強(qiáng)，后者又與啟動(dòng)子DNA結(jié)合， 此三元復(fù)合體使其中各組分的結(jié)合趨于穩(wěn)定。

        ④通過(guò)mRNA產(chǎn)生多種穩(wěn)定的酶使信號(hào)放大。同時(shí)，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表達(dá)等檢測(cè)方法均很敏感。

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