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        RNA pull-down實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)與常見(jiàn)問(wèn)題由普拉特澤生物為大家總結(jié)分享，普拉特澤生物分子檢測(cè)平臺(tái)為廣大科研人員提供RNA pull-down實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)與技術(shù)咨詢(xún)服務(wù)，在大量的實(shí)操與技術(shù)咨詢(xún)中，我們總結(jié)了很多注意事項(xiàng)，也遇到、聽(tīng)到了很多實(shí)驗(yàn)問(wèn)題，見(jiàn)天=我們就把實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的各種注意事項(xiàng)與常見(jiàn)問(wèn)題分享給大家，希望能給大家?guī)椭?/span>~

        一、RNA pull-down實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

        1、實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備

        （1）首先是樣本的收集和處理，如果樣本是細(xì)胞，要考慮細(xì)胞中該RNA的表達(dá)量，如果RNA含量較低，那提取出來(lái)的RBP可想而知會(huì)非常少， 建議大家提前準(zhǔn)備較多的細(xì)胞。（ 本人的試劑盒要求的量是107個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)操作時(shí)使用了8個(gè)10 cm大皿。）也看到很多小伙伴說(shuō)可以先進(jìn)行過(guò)表達(dá)該RNA后再進(jìn)行pull-down實(shí)驗(yàn)，大家可以嘗試。

        （2）由于該實(shí)驗(yàn)我們提取的目的蛋白和細(xì)胞中的RNA含量都較低，因此更需要注意的是： 實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程預(yù)防RNA和蛋白的降解！進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的前兩天，一定要準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)需要的 槍頭，EP管等。均需 無(wú)酶無(wú)菌！提前高壓，做好準(zhǔn)備，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)，戴好手套和口罩！實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)提前使用DEPC水擦拭！剩余耗材準(zhǔn)備： 磁力架，碎冰，低溫高速離心機(jī)，冰盒，漩渦振蕩器。

        2、實(shí)驗(yàn)操作重點(diǎn)

        實(shí)驗(yàn)的操作，一般要注意以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟。

        （1）探針的制備：這步強(qiáng)烈建議大家交給靠譜的公司進(jìn)行構(gòu)建，便宜好用易上手！

        （2）探針-磁珠制備：按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，沒(méi)有任何問(wèn)題。

        （3）蛋白樣本的提取，除核酸：即制備蛋白樣本。如果設(shè)計(jì)的組較多，可以選擇 分別提取，每次提取的蛋白樣本可短時(shí)間內(nèi)，凍存于-80度冰箱低溫保存。

        （4）RNA pull-down：同樣是按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。重點(diǎn)： 到最后一步孵育洗脫后收集上清（即最終樣本），大家可以根據(jù)自己的情況，加適當(dāng)量buffer（減少量）！例如本人試劑盒上寫(xiě)60μL，但加上60μL后，蛋白濃度太低，以至于后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行有些困難。

      
        二、RNA pull-down實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題與處理方法

        問(wèn)題1：RNA 降解

        可能原因：

        1）無(wú)核酸酶的環(huán)境被破壞

        2）體外轉(zhuǎn)錄的RNA探針降解

        解決方法：

        1）清洗和使用新開(kāi)的離心管和試劑等

        2）RNA探針合成后，電泳檢測(cè)其長(zhǎng)度和濃度

        問(wèn)題2：RNA結(jié)合蛋白的親和力不夠：

        可能原因：

        1）結(jié)合緩沖環(huán)境沒(méi)有優(yōu)化

        2）裂解不完全

        3）磁珠用量不足

        4）RNA探針用量不足

        解決方法：

        1）優(yōu)化孵育時(shí)間、溫度 、鹽濃度等條件

        2）增加裂解液和蛋白上樣量的比例

        3）增加裂解液

        4）增加磁珠用量

        5）增加探針用量

        6）確定生物素和鏈霉親和素效率

        問(wèn)題3：RNA結(jié)合蛋白沒(méi)有結(jié)合

        可能原因：

        1）靶蛋白量不足

        2）緩沖體系不對(duì)

        3）RNA探針和蛋白的親和力本來(lái)就低

        解決方法：

        1）增加上樣蛋白量

        2）應(yīng)用低鹽體系

        3）加入交聯(lián)試劑

        問(wèn)題4：結(jié)合的非特異性高

        可能原因：

        1）緩沖環(huán)境沒(méi)有優(yōu)化

        2）緩沖環(huán)境嚴(yán)謹(jǐn)性低

        3）樣品沒(méi)有裂解完全和裂解體系沒(méi)有優(yōu)化

        解決方法：

        1）優(yōu)化孵育時(shí)間溫度 鹽濃度等條件

        2）使用嚴(yán)謹(jǐn)性高的緩沖體系

        3）調(diào)低RNA探針和樣品的比例

        4）提高裂解液的量

        好啦，RNA pull-down實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)與常見(jiàn)問(wèn)題咱們就講完啦，如果沒(méi)有您遇到的問(wèn)題的話(huà)可以留言給客服，技術(shù)會(huì)第一時(shí)間給到您回復(fù)的，有需要RNA pulldown實(shí)驗(yàn)外包的需求的話(huà)歡迎選擇普拉特澤生物！