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  大家好，今天普拉特澤生物技術(shù)來回答一下大家關(guān)于RNA pull-down實驗的各種疑難問題。RNA pull-down是研究蛋白互作的核心技術(shù)，也是普拉特澤生物分子檢測平臺的常規(guī)實驗手段，為廣大科研人員提供RNA pull-down實驗外包與技術(shù)咨詢服務(wù)，本文就來分享RNA pull-down大家提過的各種問題，記好小本本哦！

        1、RNA pull-down的實驗如何防止RNA降解？

        RNA pull-down實驗的一大難點就是RNA本身易降解，所以過程中要禁止RNase，以防止降解。因此在整個實驗過程中除了EP管、槍頭、鑷子這些常用的器具需要滅菌，所有試劑均需要DEPC·H2O配置并滅菌！處理后的耗材需要盡快用掉，超過兩周則需要重新處理。操作臺需要用RNaseZAP擦凈，以去除環(huán)境中的RNA酶的影響。

        2、RNA pull-down的實驗如何防止RNA降解？

        實驗中RNA與蛋白結(jié)合的親和力低怎么解決？

        首先確定是不是①緩沖環(huán)境有沒有優(yōu)化、②裂解完不完全、③磁珠用量、④RNA探針用量這幾個方面有問題，依次排除，如果都沒有問題，就要考慮是不是RNA連接生物素的效率低的問題，如果是，那么：

        (1)可能是RNA純度不夠，需要重新純化

        (2)RNA沒有變性完全

        (3)連接的時間短，建議連接時間不要少于4小時，必要時可以16℃過夜。

        3、RNA pull-down后銀染，條帶背景深是什么原因？

        考慮是不是SDS-PAGE染色時間過長或者抗體的質(zhì)量問題，多克隆抗體經(jīng)常會出現(xiàn)這種情況，最有可能的情況是樣品中包含的非特異性蛋白太多了，針對這一點，有以下解決措施：

        (1)優(yōu)化孵育時間、溫度、鹽濃度等條件

        (2)優(yōu)化緩沖體系，使用嚴(yán)謹(jǐn)性高的緩沖體系

        (3)提高裂解液的質(zhì)量

        電泳后看不到蛋白條帶是不是就代表RNA與蛋白不互作？

        也有可能是體外轉(zhuǎn)錄的RNA序列有問題；樣品中蛋白質(zhì)濃度過低同樣難以觀測到條帶，當(dāng)然還會存在實驗操作失誤的問題。

        4、RNA pull-down實驗前富集LncRNA都有哪些方法？

        富集LncRNA問題其實也就是LncRNA如何被鏈霉親和素識別以及如何帶上生物素標(biāo)記的問題，大致上有三種方法:

        (1)探針法:

        針對該LncRNA的序列，設(shè)計生物素標(biāo)記的探針。此種方法最關(guān)鍵的是探針的特異性，所以最好用Northern Blot檢測探針的特異性。 可以結(jié)合內(nèi)源的LncRNA是探針法的最大優(yōu)勢。缺點就是比較貴，需要的樣品量大。

        (2)生物素標(biāo)記法:

        在LncRNA的5‘端加上T7啟動子，利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，可以制備大量的LncRNA。再通過生物素標(biāo)記試劑盒，就能得到大量的生物素標(biāo)記的LncRNA。常用的折疊的方法退火，從95℃退火到4℃，大約30秒一度就可以了。

        (3)TRSA法:

        除了生物素，鏈霉親和素還可以識別TRSA結(jié)構(gòu)，因此在LncRNA的一端加上TRSA序列也是不錯的選擇。

        5、RNA pull-down的實驗有對照嗎？

        有，探針法和生物素標(biāo)記法的對照都是相應(yīng)的反義序列：探針的反義序列以及長非編碼RNA的反義序列。TRSA法的對照是TRSA序列本身。

        關(guān)于RNA pull-down實驗的問題我們就講到這里啦，如果您還有關(guān)于RNA pull-down實驗的技術(shù)問題歡迎隨時聯(lián)系我們，如果您有RNA pull-down實驗外包的需求歡迎聯(lián)系普拉特澤~