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  RNA pull-down實(shí)驗(yàn)步驟由普拉特澤生物為大家總結(jié)分享，RNA pull-down作為研究RNA與蛋白互作的核心技術(shù)，已成為研究焦點(diǎn)。普拉特澤生物分子檢測(cè)中心承接RNA pull-down實(shí)驗(yàn)代做上百例，總結(jié)了一套自己的高效常用的RNA pull-down實(shí)驗(yàn)步驟，分享給初次接觸本實(shí)驗(yàn)的實(shí)操小白們，希望能幫到你哦！

  RNA pull-down其目的是檢測(cè)與RNA互作的蛋白。實(shí)驗(yàn)過程簡(jiǎn)單來說就是把感興趣的RNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，并標(biāo)記（如生物素標(biāo)記），再與細(xì)胞裂解液共同孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后將分離得到蛋白質(zhì)，通過WB 或質(zhì)譜進(jìn)行驗(yàn)證或鑒定。

        1、磁珠準(zhǔn)備

        （1）取3 μg Biotin標(biāo)記的RNA，加入適量Structure Buffer，使得RNA形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。然后將RNA 95℃加熱2 min，冰浴3 min，室溫靜置30 min；

        （2）磁珠準(zhǔn)備：使用RIP Lysis 500 μL沖洗磁珠3次，用50 μLRIP Lysis Buffer重懸磁珠；

        （3）將磁珠加入到第（1）步的RNA中，室溫孵育1h；

        （4）將磁珠與RNA的混合物去上清；

        （5）RIP Lysis Buffer沖洗3次，切記將液體沿壁加入或滴加，上下緩慢翻轉(zhuǎn)混勻。

        2、 RNA Pull down（提取總蛋白做）

        （1）用500 uL RIP Lysis Buffer（使用時(shí)加入RNase抑制劑與蛋白酶抑制劑）裂解細(xì)胞，并用細(xì)胞破碎器破碎細(xì)胞，冰上裂解15 min，4℃ 12000 rpm離心20 min，棄沉淀，保留上清；

        （2）往2.1制備的磁珠-RNA混合物中加入上述上清液，室溫孵育2 h；

        （3）將孵育好的磁珠-RNA-蛋白混合物棄上清，使用RIP Lysis Buffer沖洗5次，1次1 mL；

        （4）向磁珠中加入生物素洗脫液，室溫、混勻儀上洗脫15 min；

        （5）放入磁性分離器中，將液體轉(zhuǎn)移到新的EP管中，該液體即為洗脫產(chǎn)物；

        （6）取部分洗脫產(chǎn)物于混合物中加2×SDS上樣緩沖液，95℃變性10 min，跑SDS-PAGE凝膠；剩下的產(chǎn)物可用于質(zhì)譜。

        3、SDS-PAGE與染色

        配制好膠，將準(zhǔn)備好樣品上樣，恒流，16mA/膠，直至溴酚藍(lán)跑至膠底部，完成電泳。電泳結(jié)束后，用硝酸銀染色

        （1）固定：30 min（乙醇：乙酸：水=4：1：5體積比）；

        （2）敏化：30 min（乙酸鈉10.2 g，硫代硫酸鈉0.471 g，乙醇45 mL，加水至150 mL）；

        （3）水洗4次，每次10 min；

        （4）銀染：30 min（硝酸銀0.375 g，加水至15 mL）；

        （5）水洗2次每次40s；

        （6）顯色：顯影至條帶清楚（碳酸鈉4.5g，72 uL甲醛，加水至180 mL）；

        （7）終止：5 min（Na2EDTA   2.19g，加水至150 mL ） 。

        好啦，那關(guān)于RNA pull-down實(shí)驗(yàn)的操作步驟咱們就講完啦，沒有看懂的話可以隨時(shí)給我們留言，技術(shù)會(huì)詳細(xì)給到解答的哦；。如果您有RNA pull-down實(shí)驗(yàn)外包與代做的需求，歡迎選擇普拉特澤~