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  今天普拉特澤生物跟大家一起學(xué)習(xí)的是酵母雜交實(shí)驗(yàn)的常見問題—轉(zhuǎn)化篇，酵母雜交技術(shù)是一種體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)，蛋白質(zhì)作為生命活動中最終的執(zhí)行者和體現(xiàn)者，被越來越多的科研人員研究。而普拉特澤生物——分子檢測平臺也非常重視這一點(diǎn)，為廣大科研人員提供酵母單雙雜實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)，同時也總結(jié)了在酵母雜交實(shí)驗(yàn)過程中常遇到的各種問題，分享給大家一起共勉！

  問題一：菌種是否需要兩次平板活化？

  答：根據(jù)菌種生長的具體情況。初始菌為1個月內(nèi)活化過的酵母平板菌落，只需要進(jìn)行一次平板活化；新鮮轉(zhuǎn)化產(chǎn)物用于感受態(tài)制備，不需要平板活化，直接小搖即可；-80 ℃保存的菌種，建議經(jīng)過兩次平板活化后，選擇生長良好的菌落再進(jìn)行搖菌。

  問題二：感受態(tài)制備是否必須經(jīng)過先小搖，然后再大搖？

  答：是的。標(biāo)準(zhǔn)流程是先小搖，再大搖，保證對數(shù)期的酵母細(xì)胞的比例，才能得到理想的轉(zhuǎn)化效率；不經(jīng)小搖，直接過夜大搖，用Coolaber酵母轉(zhuǎn)化試劑盒檢測，也可以得到較高的轉(zhuǎn)化效率。單個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化或者是兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)，可以直接大搖，但進(jìn)行文庫轉(zhuǎn)化，為了得到更多的轉(zhuǎn)化子，必須先小搖后再大搖。

  問題三：感受態(tài)制備過程中，菌的濃度有什么要求？

  答：最適的菌濃度OD值=0.5，最好為自然生長的濃度，不是由高濃度稀釋而來的濃度。

  問題四：感受態(tài)制備完成可以保存多久？

  答：看細(xì)胞的具體情況。Super轉(zhuǎn)化Kit和Super轉(zhuǎn)化Kit plus含有經(jīng)優(yōu)化的感受態(tài)細(xì)胞凍存液，-80 ℃感受態(tài)細(xì)胞可以保存6-12個月。未加凍存液的感受態(tài)細(xì)胞室溫只能保存6 h。

  問題五：轉(zhuǎn)化產(chǎn)物用無菌水和生理鹽水重懸有什么區(qū)別？

  答：重懸后直接涂板，生理鹽水和無菌水無區(qū)別；如果過夜后涂板，用生理鹽水重懸，細(xì)胞的存活率會更高。

  問題六：轉(zhuǎn)化產(chǎn)物一般重懸體積是多少，涂板量是多少？

  答：單個或者兩個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，建議200 μL重懸，直徑9 cm培養(yǎng)皿涂布100 μL；文庫轉(zhuǎn)化，建議5-10 mL重懸，直徑15 cm培養(yǎng)皿涂布300 μL。

  問題七：轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的培養(yǎng)溫度，以及培養(yǎng)的時間怎么確定？

  答：28-30 ℃培養(yǎng)48 h會有微小菌落出現(xiàn)，3天后會出現(xiàn)較大的乳白色菌落。如果培養(yǎng)基含有抗生素或細(xì)胞表達(dá)蛋白對自身有毒性，培養(yǎng)時間需延長，菌落也會偏小一些。

  問題八：如何判斷是否轉(zhuǎn)化成功？

  答：平板出現(xiàn)乳白色單菌落，直徑可達(dá)1 mm以上，判斷為轉(zhuǎn)化成功；如果平板出現(xiàn)一層菌落，或者菌落都太小，不能挑取單菌落，判斷為轉(zhuǎn)化失敗。常見的失敗多為篩選平板上沒能長出任何菌落。

  問題九：酵母轉(zhuǎn)化質(zhì)粒加入多少合適？

  答：對于高純度質(zhì)粒，單轉(zhuǎn)建議質(zhì)粒加入量100 ng以上，共轉(zhuǎn)建議質(zhì)粒加入量每種300 ng以上，文庫轉(zhuǎn)化建議文庫質(zhì)粒加入量為5-25 μg。質(zhì)粒的加入量和轉(zhuǎn)化子的數(shù)量呈正相關(guān)，為了得到較高的轉(zhuǎn)化效率，對于通過NanoDrop定量的質(zhì)粒，單轉(zhuǎn)和共轉(zhuǎn)均建議每種質(zhì)粒加入1 μg以上。如出現(xiàn)轉(zhuǎn)化失敗的問題，請優(yōu)先檢測質(zhì)粒的質(zhì)量，電泳是最為簡單有效的方法。

  問題十：轉(zhuǎn)化失敗的原因有哪些？

  答：最常見的轉(zhuǎn)化失敗為空板，沒有菌落長出來。大概率問題出在質(zhì)粒上，首先需要對質(zhì)粒進(jìn)行電泳檢測，電泳結(jié)果需為大小正確且明亮的條帶；其次核對篩選培養(yǎng)基的選用和配制是否正確；排除上述因素，就需要復(fù)查酵母菌的外觀氣味是否正常，或者進(jìn)行鏡檢。

  問題十一：文庫轉(zhuǎn)化怎么計算轉(zhuǎn)化效率？

  答：文庫轉(zhuǎn)化需要盡可能保證文庫的完整性，得到盡可能多的轉(zhuǎn)化子。一般認(rèn)為在缺陷平板（不含報告基因檢測缺陷及抗生素平板）上得到十萬個以上轉(zhuǎn)化子為合格。比如10 μL的重懸產(chǎn)物，取1 μL稀釋到100 μL涂板后得到10個以上克隆，轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)即為成功的。

  問題十二：線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化失敗怎么解決？

  答：由于要重組基因組，需要線性化質(zhì)粒，但其轉(zhuǎn)化效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于環(huán)狀質(zhì)粒，一般每μg質(zhì)粒只能得到50個以內(nèi)的轉(zhuǎn)化子。由于酶切體系以及純化方法的影響，造成質(zhì)?；厥招实?、質(zhì)量差，是轉(zhuǎn)化失敗的主要因素。建議選用質(zhì)粒大提試劑盒增加質(zhì)粒的提取量，擴(kuò)大酶切體系，改善回收方法來解決。酶切完成后，只取少量電泳檢測，對于完全酶切的樣品，直接用吸附柱純化；和酶切產(chǎn)物全部電泳后膠回收相比，質(zhì)粒的損耗率小一些。

  好啦，那所有的酵母雜交操作時的常見問題我們就講完啦，如果您還有其他操作時的問題我們會第一時間給到回復(fù)，如果您有酵母雜交實(shí)驗(yàn)外包的需求歡迎隨時聯(lián)系普拉特澤~