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  酵母單雜交實驗步驟由普拉特澤生物總結(jié)分享。酵母單雜交(Yeast one-hybrid)是根據(jù)DNA結(jié)合蛋白(即轉(zhuǎn)錄因子)與DNA順式作用元件結(jié)合調(diào)控報告基因表達的原理，克隆與靶元件特異結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子基因(cDNA)的有效方法。普拉特澤生物——分子檢測平臺專業(yè)承接酵母單雜實驗外包服務(wù)，總結(jié)了一套常用的酵母單雜實驗步驟，一起來學習吧！

        一、構(gòu)建誘餌菌株

        1、制備YM4271感受態(tài)細胞

        2、取上述感受態(tài)菌液，與1μg pHisi-cor promoter質(zhì)?；靹蚝蠹尤腩A冷為0.2cm（electrode gap）電擊轉(zhuǎn)化杯（cuvette）中，置于冰上3min；

        3、設(shè)置BTX電轉(zhuǎn)儀的參數(shù)進行電轉(zhuǎn)化（高壓脈沖1.8kV）5ms；

        4、吸出菌液后涂布至SD/ Ura-平板，正置1小時，然后28℃倒置培養(yǎng)2-5天，待其長出明顯的單菌落。

        5、從平板上挑取單克隆落接種到2mL的液體SD/ Ura-中，30℃振蕩培養(yǎng)過夜OD600達0.6-1.0。

        二、自激活驗證

        1、以上步擴大培養(yǎng)的菌株，進行感受態(tài)細胞制備

        2、取該感受態(tài)菌液，與1μg pGADT7 AD質(zhì)?；靹蚝蠹尤腩A冷為0.2cm（electrode gap）電擊轉(zhuǎn)化杯（cuvette）中，置于冰上3min；

        3、設(shè)置BTX電轉(zhuǎn)儀的參數(shù)進行電轉(zhuǎn)化（高壓脈沖1.8kV）5ms；

        4、吸出菌液后涂布至SD/ Ura-Leu-平板，正置1小時，然后28℃倒置培養(yǎng)2-5天，待其長出明顯的單菌落。

        5、從平板上挑取單克隆落接種到2mL的液體SD/ Ura-Leu-中，30℃振蕩培養(yǎng)過夜OD600達0.6-1.0。

        6、配制含有不同濃度3-AT的SD/ Ura-Leu-平板，濃度設(shè)置為10，15，20，50ug/ml。

        7、按照五個稀釋梯度，每滴2ul進行酵母點菌實驗，28℃倒置培養(yǎng)3天，發(fā)現(xiàn)以上4個 3-AT濃度梯度下，均無菌落生長，選擇5ug/ml 3-AT作為后續(xù)互作驗證篩選濃度。

        三、轉(zhuǎn)化誘餌菌株

        1、以步驟1中擴大培養(yǎng)的cor promoter誘餌菌株，進行感受態(tài)細胞制備

        2、取該感受態(tài)菌液，與1μg pGADT7-bHLH3質(zhì)?；靹蚝蠹尤腩A冷為0.2cm（electrode gap）電擊轉(zhuǎn)化杯（cuvette）中，置于冰上3min；

        3、設(shè)置BTX電轉(zhuǎn)儀的參數(shù)進行電轉(zhuǎn)化（高壓脈沖1.8kV）5ms；

        4、吸出菌液后涂布至SD/ Ura-Leu-平板，正置1小時，然后28℃倒置培養(yǎng)2-5天，待其長出明顯的單菌落。

        5、從平板上挑取單克隆落接種到2mL的液體SD/ Ura-Leu-中，30℃振蕩培養(yǎng)過夜OD600達0.6-1.0。

        相同方法轉(zhuǎn)化cor promoter mutant誘餌菌株和jaz3 promoter誘餌菌株。

        四、陽性對照酵母YM4271/pGADT7-P53/SV40復蘇

        1、取凍存的酵母YM4271/pGADT7-P53/SV40細胞，用接菌環(huán)在融化的菌液表面蘸一下，在SD/-Leu固體平板上劃線，30℃倒置培養(yǎng)2天；

        2、從平板上挑取單克隆落接種到液體SD/-Leu中，30℃振蕩培養(yǎng)過夜至OD600達0.8

        五、陰性對照酵母YM4271/pGADT7-lam/SV40復蘇

        1、取凍存的酵母YM4271/pGADT7-lam/SV40細胞，用接菌環(huán)在融化的菌液表面蘸一下，在SD/-Leu固體平板上劃線，30℃倒置培養(yǎng)2天；

        2、從平板上挑取單克隆落接種到液體SD/-Leu中，30℃振蕩培養(yǎng)過夜至OD600達0.8

        六、點菌

        1、分別配制含有5ug/ml 3-AT的SD/-Leu/-his/-Trp平板和SD/-Leu/-Trp平板。

        2、將步驟3~5中擴大培養(yǎng)的菌株，按照五個稀釋梯度，每滴2ul進行酵母點菌實驗，28℃倒置培養(yǎng)7天，進行掃描觀察。

        學會了嗎？酵母單雜實驗的詳細操作步驟我們就全部介紹到這里啦，希望能給正在進行實驗設(shè)計的你一些參考，如果您有酵母單雜實驗外包的需求可以直接給客服留言，技術(shù)會馬上給到回復~我們下期見！