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        DNA pull down實(shí)驗(yàn)問題答疑由普拉特澤生物分子檢測平臺分享，上期分享了DNA pull down實(shí)驗(yàn)的操作步驟，大家學(xué)習(xí)后都提出了很多關(guān)于DNA pull down實(shí)驗(yàn)的問題，今普拉特澤生物的技術(shù)就來一個個回答：

        問題一：DNA pull down的原理？

        DNA pull down的原理是先將含脫硫生物素的DNA pull down探針結(jié)合到鏈霉親和素Beads上，再將DNA-Beads和細(xì)胞裂解液孵育，這樣DNA結(jié)合蛋白便一起吸附在Beads上。洗滌掉未結(jié)合的蛋白后，再用洗脫液將DNA結(jié)合蛋白從Beads洗脫下來，得到DNA pull down產(chǎn)物。DNA-protein復(fù)合物既可以做Western-Blot檢測特定蛋白是否與靶DNA片段結(jié)合，又可以做質(zhì)譜鑒定篩選出與DNA片段可能互作的蛋白信息（如具體某個或某些轉(zhuǎn)錄因子/組蛋白等）。

        問題二：DNA pull down的應(yīng)用背景是什么？

        DNA pull down以感興趣的DNA序列為中心，尋找與該序列結(jié)合的蛋白質(zhì)，最常見的應(yīng)用是尋找某特定基因啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子。

        啟動子通常位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游，含有RNA聚合酶特異性結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始所需的保守序列。

        轉(zhuǎn)錄因子也稱為反式作用因子，是一種DNA結(jié)合蛋白，它能夠與真核基因的順式作用元件特異性結(jié)合來激活或抑制基因表達(dá)。

        一個基因的啟動子通常會結(jié)合多種轉(zhuǎn)錄因子，尋找啟動子序列的特異轉(zhuǎn)錄因子，有助于我們理解這些啟動子下游的功能基因是如何被調(diào)控的。

        問題三：DNA pull down探針怎么設(shè)計？

        DNA pull down的探針長度一般情況下控制在300-4000bp，理想?yún)^(qū)間為1000-2000bp，之所以如此設(shè)計，是因?yàn)樘结樚L或太短都不太好，太短結(jié)合的蛋白太少，太長的話，它會存在大量的非特異性結(jié)合（整個反應(yīng)條件里面我們要求是無核酸酶的），盡量避免DNA的序列有非常多的重復(fù)結(jié)構(gòu)、或者高GC含量等。

        問題四：DNA Pull down如何設(shè)計對照組？

        DNA Pull down的對照通常有兩種方案，一種方案是選擇一個非生物素標(biāo)記的DNA序列作為對照組，將來拿到的數(shù)據(jù)，主要是去除根鏈親和素的樹脂結(jié)合的一些蛋白。 第二種方案是使用一個無義的序列，這個需要用生信的方法跟基因組數(shù)據(jù)比對。 也有對照用LacZ基因作為對照，這個比較多人用，我們有時候也會用GFP的序列，其實(shí)就是找一段無關(guān)序列。當(dāng)然，如果為了有一些明確的基因序列需要剔除的話，我們可以用一些其他的基因序列作為對照組來做這個實(shí)驗(yàn)。

        問題五：與探針結(jié)合的蛋白怎么制備？

        做DNA Pull down的蛋白一般有兩種，分別是核蛋白與總蛋白，這個有什么區(qū)別呢？因?yàn)?/span>DNA結(jié)合的區(qū)域，大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子，我們盡量選取核蛋白來進(jìn)行，減少雜蛋白的干擾。但是有一些材料，他的細(xì)胞核或者和核蛋白非常困難，或者分離我們研究的不是跟轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，而是跟組織蛋白或者結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合的，這種情況下我們就選用總蛋白。

        問題六：DNA pull down與RNA pull down的差別？

        在我們大多數(shù)人的潛意識里會認(rèn)為DNA pull down可能會更簡單一點(diǎn)，但實(shí)際上RNA成功率更高，結(jié)合的蛋白會更多，這是為什么呢？這個地方就取決于我們的探針了，做DNA Pull down的時候，我們的DNA探針是用雙鏈的，大家都知道雙鏈的DNA探針，它會形成一個雙螺旋的結(jié)構(gòu)，相對來講它是比較穩(wěn)。而RNA是單鏈的，它會自我形成很多的這種二級結(jié)構(gòu)，我貼了一張二級結(jié)構(gòu)圖，在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)之上，會形成三級結(jié)構(gòu)，四級結(jié)構(gòu)，它就像有點(diǎn)像是蛋白質(zhì)。它會形成一個非常復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，這種非常復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)相對于DNA的雙螺旋鏈來講，蛋白質(zhì)的結(jié)合的概率將會大大增加，因此RNA pull down，成功率將會更高一些，當(dāng)然了，這個事情也不絕對，因?yàn)?/span>RNA本身不是特別穩(wěn)定的，我們操作如果說不小心或者是失誤的話啊，會出現(xiàn)降解的情況。

        好啦，那所有的問題就都回答完啦，如果您還有關(guān)于DNA pulldown實(shí)驗(yàn)外包的需求或者其他技術(shù)問題，也可以直接留言，我們會第一時間給到回復(fù)的哦，我們下個實(shí)驗(yàn)見！