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  大家好，今天普拉特澤生物跟大家一起看的是DNA pulldown實(shí)驗(yàn)操作步驟。DNA pull down是研究DNA和蛋白質(zhì)互做關(guān)系的非常重要的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)步驟由普拉特澤生物分析檢測(cè)平臺(tái)技術(shù)總結(jié)分享，歡迎科研實(shí)驗(yàn)人員聯(lián)系互相交流。

        1．探針設(shè)計(jì)及標(biāo)記

        ①　采用基因組DNA做模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子片段；

        ②　將其克隆至pMD-18T克隆載體，并測(cè)序鑒定成功；

        ③　使用PCR法或末端標(biāo)記法標(biāo)記探針；

        ④　標(biāo)記的探針利用凝膠回收試劑盒純化回收探針，并檢測(cè)探針濃度；

        ⑤　-20℃保存，待用；

        2．Pull down

        ①　預(yù)先混合 5 μg 生物素標(biāo)記的 DNA 和 500 μg 核蛋白，置于冰上；

        ②　取 100μL Streptavidin-agaroseG 串珠，用冰冷 PBS 洗一次，5000 g 離心 30 秒；

        ③　將 DNA 與蛋白的混合物加到串珠中，重懸珠子；

        ④　4℃孵育 1 小時(shí)；

        ⑤　5000g，離心 30 秒，去除上清，收集沉淀；

        ⑥　用冰冷 PBS 洗串珠三次，5000 g 離心 1 分鐘，盡可能去除上清，收集沉淀；

        ⑦　 加入 30 μL 蛋白上樣緩沖液，重懸沉淀，沸水煮 10 分鐘，

        3．蛋白質(zhì)檢測(cè)-- Western Blot

        ①　電泳：實(shí)驗(yàn)采用不連續(xù)系統(tǒng)蛋白質(zhì)SDS-PAGE，濃度為5%濃縮膠和8~12%濃度分離膠；每孔上樣40~60 ug總蛋白，開始電壓為100 v,到達(dá)分離膠后調(diào)為120 v；

        ②　轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜為恒流轉(zhuǎn)膜，電流為200 mA，時(shí)間根據(jù)目的蛋白分子量選擇60~120 min。

        ③　封閉：蛋白膜放置到TBST溶液中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液；加入5%脫脂奶粉封閉液，室溫50rpm，封閉60分鐘。

        ④　孵育一抗：根據(jù)蛋白Marker指示將PVDF膜剪開，參考一抗?jié)舛?；?/span>PVDF膜分別放入含各自一抗溶液中，4度孵育一抗過夜，然后放入TBST洗滌液，搖動(dòng)洗滌3次，每次15 min。

        ⑤　孵育二抗：參考二抗?jié)舛?，按比例稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。將PVDF膜加入稀釋好的二抗，室溫?fù)u動(dòng)孵育1h；放入TBST洗滌液，搖動(dòng)洗滌3次，每次15 min。

        ⑥　顯色：使用化學(xué)發(fā)光試劑，黑暗處顯色，用X光片壓片，顯影液及定影液洗片。

        4．蛋白質(zhì)檢測(cè)-- MS

        ①　切膠：用刀片切取膠粒（膠粒直徑1-2 mm），置于1.5mL EP管中。

        ②　清洗：用200 uL MilliQ震蕩清洗2次，每次10分鐘。

        ③　脫色：對(duì)于考染膠，加考染膠色液（25mM NH4HCO3， 50% ACN）200uL，37℃ 20分鐘或超聲脫色5分鐘，吸干，重復(fù)脫色2-3次，至藍(lán)色褪去。

        ④　脫水：加ACN 100 μL脫水至膠粒變白，吸棄ACN。

        ⑤　清洗：用200 μL MilliQ震蕩清洗2次，每次10分鐘；然后用200uL 50% ACN震蕩清洗2次，每次10分鐘。

        ⑥　脫水：加ACN 100 μL 脫水至膠粒變白，吸棄ACN。

        ⑦　用25 mM NH4HCO3稀釋Trypsin 至12.5 mg/ml，每管加10 μL，稍微離心一下，讓酶液與膠粒充分接觸，4℃放置30 min ，待酶液被膠粒完全吸收，吸棄多余的酶液，加25 mM NH4HCO3 20uL，37℃過夜(16h)。

        ⑧　質(zhì)譜樣品使用德國Bruker公司的Ultraflex III質(zhì)譜儀開展分析，參數(shù)設(shè)置：反射模式；

        ⑨　離子源加速電壓1為24kv；

        ⑩　加速電壓2為22kv；

        11　離子延遲提取0.000ns；

        12　真空度1.4×10-7 Torr；

        13　質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加200次；

        14　使用標(biāo)準(zhǔn)Maker峰作為外標(biāo)校正質(zhì)譜峰，正離子譜測(cè)定，測(cè)定范圍控制在700-4000；

        15　樣品的肽質(zhì)量指紋圖譜，胰酶自降解峰和污染物質(zhì)的峰自動(dòng)剔除；

        16　利用LIFT軟件將PMF強(qiáng)度最大的5個(gè)峰進(jìn)行串級(jí)質(zhì)譜分析（峰強(qiáng)度大于300）。

        OK，那DNA pull-down實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)操作步驟我們就分享你到這里啦，如果您還有什么問題的可以直接留言，有需要DNA pull-down實(shí)驗(yàn)外包或代做的老師也可以直接留言需求，技術(shù)會(huì)第一時(shí)間給到回復(fù)的！