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   大家好呀，今天小編給大家分享的就是Co-IP（免疫共沉淀）實驗的詳細操作步驟，雖然是分子互做實驗中的常規(guī)實驗，但還是有很多人問咱們的技術(shù)人員實驗細節(jié)，今天小編就給大家詳細分享一下吧。本文由普拉特澤生物分子檢測平臺技術(shù)總結(jié)分享，coip作為分子檢測中心已經(jīng)承接了上千例關(guān)于Co-IP外包實驗，積累了豐富的實驗操作經(jīng)驗，文尾還附有Co-IP理論+實操的操作視頻，愛學(xué)習(xí)的同學(xué)可以沖了哦！

   Co-IP是經(jīng)典的利用抗體從樣品中捕獲靶蛋白及其互作蛋白、復(fù)合體的一項技術(shù)，能夠特異性富集所研究的目的蛋白。

   Co-IP實驗詳細步驟：

   1、預(yù)冷PBS，RIPA Buffer，細胞刮子（用保鮮膜包好后，埋冰下），離心機。

   2、用預(yù)冷的PBS洗滌細胞兩次，最后一次吸干PBS。

   3、加入預(yù)冷的RIPA Buffer(1ml/107個細胞、10cm培養(yǎng)皿或150cm2培養(yǎng)瓶，0.5ml/5×106個細胞、6cm培養(yǎng)皿、75cm2培養(yǎng)瓶)。

   4、用預(yù)冷的細胞刮子將細胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5EP管中，4℃，緩慢晃動15min（EP管插冰上，置水平搖床上）。

   5、4℃，14000g離心15min，立即將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中。

   6、準備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠。

   7、每1ml總蛋白中加入100μl Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃10min（EP管插冰上，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白，降低背景。

   8、4℃，14000g離心15min，將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，去除Protein A珠子。

   9、(Bradford 法)做蛋白標準曲線，測定蛋白濃度，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后，可以在-20℃保存一個月）。

   10、用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μl，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果目的蛋白在細胞中含量較低，則總蛋白濃度應(yīng)該稍高（如10 μg/μl）。

   11、加入一定體積的兔抗到500μl總蛋白中，抗體的稀釋比例因目的蛋白在不同細胞系中的多少而異。

   12、4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育。

   13、加入100μl Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復(fù)合物，4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫1h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 μl"過渡抗體"（兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG）。

   14、14000rpm瞬時離心5s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，去上清，用預(yù)冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有時候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物內(nèi)部的結(jié)合，可以使用PBS。

   15、用60μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定（60 μl足夠上三道）。

   16、將上樣樣品煮5min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時凍-20℃，留待以后電泳，電泳前應(yīng)再次煮5min變性。

   好了，Co-IP免疫共沉淀實驗的詳細步驟我們就講完了，還有更多不了解的歡迎點擊：《Co-IP 理論+實操》詳細學(xué)習(xí)。同時，普拉特澤生物還提供專業(yè)的coip實驗代做與線上下實驗技能培訓(xùn)服務(wù)，快來咨詢吧！