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   下面我們就來(lái)看看chip實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)操作步驟吧！

   第一步、細(xì)胞的甲醛交聯(lián)與超聲破碎。

   （1）取出細(xì)胞，加入甲醛，使得甲醛的終濃度為1%。

   （2）37℃孵育10 min。

   （3）終止交聯(lián)。

   （4）吸盡培養(yǎng)基，用冰冷的PBS清洗細(xì)胞2次。

   （5）細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞于15 mL離心管中。預(yù)冷后離心收集細(xì)胞。

   （6）倒去上清。

   （7）超聲破碎。

   第二步、除雜及抗體哺育

   （1）超聲破碎結(jié)束后，離心去除不溶物質(zhì)。

   （2）在100μL的超聲破碎產(chǎn)物中，加入900μLChIP Dilution Bufer 和20μl × PIC。再各加入60μL ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4°C顛轉(zhuǎn)混勻1h。

   （3）1h后，在4攝氏度靜置10 min沉淀，700 rpm離心1 min。

   （4）取上清。各留取20 μL做為input。一管中加入1 μL抗體，另一管中則不加抗體。4°C顛轉(zhuǎn)過夜。

   第三步、檢驗(yàn)超聲破碎的效果

   （1）取100 μL超聲破碎后產(chǎn)物，加入4 μL5M NaCl，65°C處理2h解交聯(lián)。分出一半用酚/氯仿抽提。

   （2）電泳檢測(cè)超聲效果。

   第四步、免疫復(fù)合物的沉淀及清洗（第二天）

   （1）孵育過夜后，每管中加入60 μLProteinA  Agarose/Salmon Sperm DNA。4°C顛轉(zhuǎn)2h。

   （2）4°C靜置10 min后，離心除去上清。

   （3）清洗沉淀復(fù)合物。清洗的步驟:加入溶液，在4°C顛轉(zhuǎn)10 min，4°C靜置10 min沉淀，700 rpm離心1 min，除去上清。

   （4）清洗完畢后，開始洗脫。

   （5）解交聯(lián):每管中加入20 μL 5M NaCl（NaCl終濃度為0.2M）?；靹?，65°C解交聯(lián)過夜。

   第五步、DNA樣品的回收（第三天）

   （1）解交聯(lián)結(jié)束后，每管加入1μL RNaseA(MBI) ，37°C孵育1h。

   （2）每管加入10 μL 0.5M EDTA，20μL 1M Tris-HCl（pH6.5），2 μL 10mg/mL蛋白酶K。45°C處理2h。

   （3）DNA片段的回收omega膠回收試劑盒。最終的樣品溶于100μL ddH2O。

   第六步、PCR分析 

   令人禿頭的ChIP實(shí)驗(yàn)，小編就先介紹到這啦~

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