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   大家好！今天我們分享的就是分子檢測中的CHIP實操注意事項，本文由普拉特澤生物分子檢測平臺為大家總結(jié)分享。CHIP作為咱們的常規(guī)實驗，也已經(jīng)接了無數(shù)個外包的CHIP實驗了，每次實驗前總是有人跟技術(shù)吐槽，明明我就是照著人家操作步驟做的呀，為什么我的結(jié)果就出不來或者一點都不理想呢？難道人家分享步驟的時候缺了一點獨門秘方不外傳的嗎？

   本文從培養(yǎng)基內(nèi)活細胞數(shù)量、交聯(lián)時間長短、消化后的片段大小、抗體的種類和特異性、常規(guī)實驗操作技術(shù)等六個方面給大家詳細講解chip實驗操作過程中的注意事項，讓大家都能做好CHIP實驗，得到一個好的結(jié)果。

   首先，活細胞的數(shù)量。

   研究的DNA-蛋白豐度直接決定了CHIP實驗所需的細胞數(shù)量，沒有固定的數(shù)量標準，這些都需要預實驗充分摸索?；罴毎嫈?shù)后，如果最終用于CHIP實驗的細胞數(shù)量太高，將直接導致甲醛交聯(lián)時間增加，間接導致細胞數(shù)量/微球菌核酸酶比例增大，這些均可造成裂解的DNA小片段過長（超過1000bp），實驗處理過程中極易丟失這些片段，最終也會造成PCR檢測困難或失敗。最佳的DNA片段長度是150bp-300bp。相反，如果過細胞數(shù)量太少，則導致細胞數(shù)量/微球菌核酸酶比例減小，最終得到的DNA片段極可能小于100bp。

   然后，甲醛交聯(lián)時間。

   1%終濃度的甲醛交聯(lián)時間推薦5-6分鐘。時間過久，會造成裂解的DNA小片段過長（超過1000bp）。時間太短，會導致交聯(lián)不完全，實驗過程中導致一部分的DNA-蛋白質(zhì)復合物分離，最終分析的結(jié)果必然是不準確的。

   第三，對照組的設(shè)置。

   CHIP實驗內(nèi)對照：染色質(zhì)斷裂后，須按一定比例留取部分染色質(zhì)溶液，此Input DNA（斷裂后的基因組DNA）作為CHIP實驗的內(nèi)對照。內(nèi)對照不僅可以驗證染色質(zhì)斷裂的效果。如果按照取樣比例換算，還可以根據(jù)Input DNA中靶序列的含量和染色質(zhì)沉淀中的靶序列含量，推算CHIP實驗效率，所以Input內(nèi)對照是必須要設(shè)置的。

   陽性抗體對照：目的抗體沉淀DNA-蛋白復合物時，必須需設(shè)置陽性抗體對照組。陽性抗體通常選擇與已知序列相結(jié)合的、各物種之間比較保守的蛋白抗體，常用組蛋白抗體。

   抗體陰性對照：目的抗體沉淀蛋白DNA復合物時，必須需設(shè)置陰性抗體對照組。陰性對照所使用的抗體可以選擇目的蛋白抗體宿主的血清蛋白。

   第四、目標蛋白抗體

   CHIP實驗中，一定一定要使用已經(jīng)過CHIP驗證的抗體，因為染色質(zhì)沉淀步驟時，蛋白和DNA處在交聯(lián)狀態(tài)，目標蛋白的結(jié)合位點形成空間阻礙，導致抗體無法與目標蛋白結(jié)合形成復合物。此外，抗體的濃度、孵育時間、孵育溫度需要根據(jù)目標蛋白的豐度決定。目標蛋白豐度較低時，可能需要調(diào)整活細胞數(shù)量、過夜4℃孵育等。

   第五、常規(guī)實驗操作

   CHIP實驗過程較長，過程繁瑣，需要反復的洗柱、離心、吸液、換管、孵育、震蕩。操作說起來很簡單，但是每一步都需要小心操作，非常考驗基本功，希望大家多多注意。

   第六步、實驗結(jié)果分析

   對于Input DNA組，采用1.8%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果應該是片段集中于150bp到350bp之間，這樣長度的DNA片段才是符合要求的。進一步，內(nèi)對照組、陰性抗體對照組、陽性抗體對照組的純化DNA先采用PCR擴增，隨后通過1.8%瓊脂糖凝膠電泳，得到的結(jié)果應該是這樣的：空白對照組無條帶、陰性抗體對照組條帶若或無、內(nèi)對照組強條帶、陽性對照組看到強條帶。只有這樣的結(jié)果才是成功的。后續(xù)才能進行RT-PCR實驗。

   滴滴滴，CHIP實驗操作的注意事項我們就講完啦！只有把這六個方面全部抓住，你的chip結(jié)果才能好看又高質(zhì)，如果您覺得有難度，普拉特澤也可以給您代做CHIP實驗哦，一定能給您交出一份滿意的實驗報告，您想自己親力親為我們也給大家準備了視頻教程，點擊《CHIP 實驗理論+實操》趕緊學起來吧！