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        RNA Dot Blot斑點雜交實操步驟由普拉特澤生物分子檢測平臺分享，Dot Blot分子生物學中用于檢測生物分子，檢測、分析和鑒定蛋白質(zhì)/核酸的一種技術。普拉特澤生物分子檢測平臺長期為大家提供Dot Blot實驗外包服務，以RNA為例將Dot Blot實操步驟分享給大家，一起學習吧！

        一、RNA乙?；?/span>Dot Blot實操步驟

        1、實驗準備

        儀器準備：超微量核酸分析儀、紫外交聯(lián)儀、水平脫色搖床、化學發(fā)光儀、超凈工作臺、微量移液器、電熱恒溫鼓風干燥箱、-80℃超低溫冰箱、移液器、臺式高速冷凍離心機、反滲透超純水機、立式圓形壓力蒸汽滅菌鍋

        試劑準備：Trizol、氯仿、異丙醇、DEPC水、1.5 mL EP管、無水乙醇、尼龍膜(帶正電荷)、BeyoECL Plus (超敏ECL化學發(fā)光試劑盒)

        2、實驗步驟

        （1）總RNA的提取

        用NanoDrop方法檢測mRNA的純度，并稀釋成不同的濃度。

        （2）RNA Dot blotting

        Step1：取出待測RNA樣本，解凍后測量RNA濃度，全程冰上操作。

        Step2：將樣品濃度統(tǒng)一，并在新的無酶管連續(xù)稀釋樣品并混勻，稀釋梯度不固定，可自己試試最好效果。我選擇的終濃度為400/200/100μg/μL 。

        Step3：離心后，將RNA樣品95℃加熱3分鐘以破壞二級結(jié)構(gòu)，結(jié)束后立即冰上冷卻，防止重新形成二級結(jié)構(gòu)。

        Step4：用1mL槍頭粗端在NC膜上留下圓形印記，以引導加樣，隨后將NC膜裁剪成合適的尺寸，轉(zhuǎn)移至干凈的塑料盒中。

        Step5：將2μLRNA樣品按順序滴在NC膜上，注意槍頭不要碰膜，樣品應在膜上自然擴散，每次加樣都需要更換槍頭。

        Step6：室溫下NC膜上稍干燥后可進行RNA與膜的交聯(lián)。方法一：37℃烘箱 30 min。方法二：254 nm波長的紫外線燈下照射30 h-1h。

        Step7：10 mL TBST清洗膜5 min，洗去未結(jié)合的RNA。

        Step8：棄去TBST，加入10 mL封閉液，室溫搖動孵育1小時。

        Step9：棄去封閉液，加入含有一抗的封閉液4℃孵育過夜。

        Step10：10 mLTBST清洗膜3次，每次10 min。

        Step11：二抗室溫孵育1小時。

        Step12：同第10步。

        Step13：ECL底物孵育5 min

        Step14：顯影儀下拍照

        Step15：拍完照后，將膜放置于10 mL亞甲藍染色緩沖液中，室溫搖動孵育30 min

        Step16：用ddH2O清洗至背景大致干凈即可，約30-60 s

        Step17：白光成像采集亞甲藍染色后的圖像作為負載對照。

        RNA Dot Blot檢測實驗步驟就介紹完啦，希望能給到正在準備Dot Blot實驗設計的您一點幫助，如果您還有什么問題或者有Dot Blot實驗外包服務，歡迎給普拉特澤留言~