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  Northern Blot印跡雜交實(shí)驗(yàn)操作步驟由普拉特澤生物總結(jié)分享，Northern Blot是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法，普拉特澤生物分子檢測平臺(tái)專業(yè)承接Northern Blot實(shí)驗(yàn)外包代做服務(wù)，實(shí)驗(yàn)真，周期短，值得信賴。

圖片來源《Feedback inhibition of L1 and alu retrotransposition through altered double strand break repair kinetics》

  Northern Blot實(shí)驗(yàn)詳細(xì)操作步驟：

      1、總RNA提取。

      2、變性膠的制備：取瓊脂糖0.2g，加入DEPC H2O12.4 ml，加熱融化，于保溫狀態(tài)下加入5×甲醛凝膠電泳緩沖液4.0ml、37%甲醛3.6ml，混勻、制膠。待膠凝固后，置1×甲醛凝膠電泳緩沖液中預(yù)電泳5min。

      3、樣品制備：取總RNA4.5μl(約20-30μg) ，加入5×甲醛凝膠電泳緩沖液 4.0μl、37%甲醛3.6μl、甲酰胺10μl，65℃溫育15min、冰浴5min。加入EB（1μg/μl）1μl、上樣緩沖液2μl。

      4、電泳：上樣，50V電泳（電泳時(shí)間約2hr左右）。電泳結(jié)束后將膠塊置紫外燈下，觀察RNA的完整性，記錄18S、28S條帶的位置（離加樣孔的距離）。

      5、將RNA從變性膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或尼龍膜：

      ① 按膠塊大小剪取膜一張，用DEPC水中浸濕后，置于20×SSC中浸泡1hr。剪去膜一角。將膠塊切去一角，并在20×SSC浸泡15min×2次。

      ② 用長和寬均大于凝膠的一塊有機(jī)玻璃板作為平臺(tái)，將其放入大的干烤皿上，上面放一張Whatman 3MM濾紙，倒入20×SSC使液面略低于平臺(tái)表面，當(dāng)平臺(tái)上方的3MM濾紙濕透后，用玻棒趕出所有氣泡。

      ③ 將凝膠翻轉(zhuǎn)后置于平臺(tái)上濕潤的3MM濾紙中央，3MM濾紙和凝膠之間不能滯留氣泡。

      ④ 用Parafilm膜圍繞凝膠四周，以此作為屏障，阻止液體自液池直接流至膠上方的紙巾。

      ⑤ 在凝膠上方放置預(yù)先已浸濕的尼龍膜，排除膜與凝膠之間的氣泡。

      ⑥ 將二張已濕潤的、與凝膠大小相同的3MM濾紙置于膜的上方，排除濾紙與濾膜之間的氣泡。

      ⑦將一疊（5-8cm厚）略小于3MM濾紙的紙巾置于3MM濾紙的上方，并在紙巾上方放一塊玻璃，然后用一個(gè)重約500克的重物壓在玻璃板上。其目的是建立液體自液池經(jīng)凝膠向膜上行流路，以洗脫凝膠中的RNA并使 其聚集在膜上。

      6、使上述RNA轉(zhuǎn)移持續(xù)進(jìn)行15hr左右。在轉(zhuǎn)膜過程中，當(dāng)紙巾浸濕后，應(yīng)更換新的紙巾。

      7、轉(zhuǎn)移結(jié)束后，揭去凝膠上方的紙巾和3MM濾紙。將膜在6×SSC中浸泡5 min，以去除膜上殘留的凝膠。

      8、將凝膠置紫外燈下，觀察膠塊上有無殘留的RNA。

      9、膜置80℃，真空干烤1-2hr?？靖珊蟮哪び盟芰洗芊猓?℃保存?zhèn)溆谩?/span>

      10、探針標(biāo)記(Prime-a-Gene Labeling System, Promega公司)：

      ① 取模板DNA 25ng于0.5ml離心管中，95-100℃變性5min，冰浴5min。

      ② dNTPmix的制備: 取dGTP 1μl、dATP 1μl、dTTP 1μl混勻。

      ③ 將下列反應(yīng)成份混合，加入上述微量離心管中：

      dNTPmix 2.0μl

      BSA(10mg/ml ) 2.0μl

      5×buffer 10.0μl

      Klenow 酶(5u/μl) 1.0μl

      α-32P-dCTP 5.0μl
      加入適量dd H2O使反應(yīng)總體積達(dá)50μl，輕輕混勻。室溫下反應(yīng)1hr。

      11、預(yù)雜交：將膜的反面緊貼雜交瓶，加入預(yù)雜交液5ml，42℃預(yù)雜交3hr。

      12、雜交：將變性的探針（95-100℃變性5min，冰浴5min）加入到預(yù)雜交液中，42℃雜交16hr。

      13、洗膜：

      ① 倒去雜交液。

      ② 2×SSC/0.1%SDS室溫洗15min。

      ③ 0.2×SSC/0.1%SDS，55℃洗15min×2次。

      14、壓片：將膜用ddH2O漂洗片刻，用濾紙吸去膜上水份。用薄型塑料紙將膜包好，置于暗盒中，在暗室中壓上X光片。暗盒置-70℃放射自顯影3～7天左右

      好啦，Northern Blot實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)操作步驟我們就全部講完啦！還有沒看懂或者有關(guān)于Northern Blot實(shí)驗(yàn)操作細(xì)節(jié)要補(bǔ)充的同學(xué)歡迎留言分享給大家哦！