northern blot實驗詳細操作報告
來源/作者:普拉特澤-生物醫(yī)學整體課題外包平臺
普拉特澤生物為廣大生命科學研究人員提供northern blot實驗外包服務,可根據實方案的要求選擇不同的檢測方法,本文就跟大家一起學northern blot實驗詳細操作報告:
印跡雜交是一項操作較為復雜的RNA分析技術,需要注意實驗的每一步驟。以下是northern blot實驗的詳細操作報告。
1. 總體實驗流程:
樣本制備 - RNA提取 - RNA凝膠電泳 - 轉移RNA到膜上 - 探針熒光標記 - 探針雜交 - 洗滌和顯像 - 數據分析和解釋
2. 樣品制備:
將要檢測的組織或細胞培養(yǎng)物收集并冷凍,制成粉末狀或液態(tài),并在含有抑制RNase酶的緩沖液中儲存。
3. RNA提取:
根據RNA提取試劑盒說明書在組織或細胞中提取RNA。確保從不同生長條件下的樣品中提取RNA,以便進行比較。
4. RNA凝膠電泳:
將RNA經過瓊脂糖凝膠電泳(類似于DNA瓊脂糖凝膠電泳)分成不同大小,并針對待測物以及相應Alt RNA處理對RNA進行負載(即形成RNA-SDS復合物),使其具有線性結構,避免降解和聚集現(xiàn)象。
5. 轉移RNA到膜上:
將瓊脂糖凝膠中已經分離的RNA轉移到支持膜上。通常使用硝酸纖維素或尼龍膜作為固定載體,并用于將分析過的RNA從瓊脂糖中轉移到固定載體上,然后進行接下來的應用。
6. 探針熒光標記:
將特異性DNA或RNA探針標記為放射性同位素、生物素或發(fā)光物質等發(fā)光物。大多數實驗室現(xiàn)在采用非放射性方法完成這個步驟,如發(fā)光、酵素標記或染料標記探針。
7. 探針雜交:
將加了熒光標記的核酸探針添加到支持膜上并孵育,使其與少量互補的RNA結合,從而生成一個穩(wěn)定的復合物。然后可以用洗滌液或冷水淬火來除去非特異的探針和雜交組件,以展現(xiàn)有特異性的信號。
8. 洗滌和顯像:
用 wash buffer 清洗雜交 blot ,移除未結合的DNA 和 RNA 探針,并清除串擾信息。通過暴露放射性探針處理交叉顯像
9. 數據分析和解釋
對blot進行數字化處理,使用相應軟件分析RNA的信號及其強度,并進行結果解釋及比較。
以上為北方印跡實驗的詳細操作步驟,需要在相應實驗室設備和試劑的支持下進行。因此,必須在指導下完成這項工作,遵守相應的安全規(guī)定和技術標準。
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