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今天普拉特澤生物跟大家一起學(xué)習(xí)的是原位雜交實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)，有同學(xué)跟小編留言說明明是按照步驟來的，得出的結(jié)果總是不理想甚至沒有結(jié)果，所以小編又去求著普拉特澤病理實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的技術(shù)姐姐為大家總結(jié)了這篇原位雜交操作時(shí)的各種注意事項(xiàng)，快點(diǎn)學(xué)起來吧！

        1、組織取材：組織取材應(yīng)盡可能新鮮。由于組織RNA降解較快，所以新鮮組織和培養(yǎng)細(xì)胞最好在30 min 內(nèi)固定。

        2、細(xì)胞組織固定目的與注意事項(xiàng)：

        （1）保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)；

        （2）最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的水平；

        （3）使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。

        最常用的固定劑是多聚甲醛，與其它醛類固定劑（如戊二醛）不同，多聚甲醛不會(huì)與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，因而不會(huì)影響探針穿透入細(xì)胞或組織。

        3、原位雜交雜交液注意事項(xiàng)：

        （1）雜交液內(nèi)除含一定濃度的標(biāo)記探針外，還含有較高濃度的鹽類、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等。

        （2）雜交液中含有較高濃度的Na+可使雜交率增加，可以減低探針與組織標(biāo)本之間的靜電結(jié)合。甲酰胺可使Tm降低，雜交液中含每1%的甲酰胺可分別使RNA：RNA，RNA：DNA，DNA：DNA的雜交溫度降低0.35℃，0.5℃和0.65℃。，所以雜交液中加入適量的甲酰胺，可避免因雜交溫度過高而引起的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞以及標(biāo)本的脫落。硫酸葡聚糖能與水結(jié)合，從而減少雜交液的有效容積，提高探針有效濃度，以達(dá)到提高雜交率的目的（尤其對(duì)雙鏈核酸探針）。

        在雜交液中加入牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等，都是為了阻斷探針與組織結(jié)構(gòu)成分之間的非特異性結(jié)合，以減低背景。

        4、原位雜交探針濃度相關(guān)注意事項(xiàng)：

        探針濃度依其種類和實(shí)驗(yàn)要求略有不同，一般為0.5—5.0 μg/ml（0.5—5.0 ng/μl）。最適宜的探針濃度要通過實(shí)驗(yàn)才能確定。

        探針的長(zhǎng)度：

        一般應(yīng)在50-300個(gè)堿基之間，最長(zhǎng)不宜超過400個(gè)堿基。探針短易進(jìn)入細(xì)胞，雜交率高，雜交時(shí)間短。

        好啦，那原位雜交操作時(shí)的注意事項(xiàng)我們就介紹到這里啦，還有更多技術(shù)問題或者原位雜交實(shí)驗(yàn)外包咨詢歡迎留言給客服，我們會(huì)一個(gè)一個(gè)回復(fù)解答的哦~