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        細胞凍存與復(fù)蘇問題答疑由普拉特澤生物——細胞實驗平臺給大家總結(jié)分享。普拉特澤生物暑期跟大家一起堅守實驗崗，細胞實驗平臺不但承接各類細胞實驗與檢測，更有上千株可售細胞株在細胞庫內(nèi)冷凍保存。大家購買細胞后總喜歡詢問細胞凍存與復(fù)蘇相關(guān)問題，今天小編就把它全部整理下來供大家參考學習！

        問題一：細胞凍存為什么要添加保護劑?

        細胞凍存是將細胞放在低溫環(huán)境，減少細胞代謝，以便長期儲存的一種技術(shù)，細胞在不加任何保護劑的情況下冷凍，細胞內(nèi)外的水分會很快形成水晶從而引發(fā)一系列的不良反應(yīng)：首先，部分蛋白質(zhì)因局部電解質(zhì)濃度增高和pH值改變而變性，導(dǎo)致細胞內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

        其次，細胞內(nèi)冰晶的形成和細胞膜系統(tǒng)上蛋白質(zhì)，酶的變性等會限礙細胞的能量代謝。再次，胞膜上的類脂蛋白復(fù)合體在冷凍中易發(fā)生破壞引起胞膜通透性的改變，使細胞內(nèi)容物喪失。

        最后，隨著冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成DNA的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷從而引起細胞死亡。

        添加冷凍保護劑可以很好的改善細胞的破壞與死亡情況。

        問題二：冷凍管應(yīng)如何解凍?

        從液氮押中取出細胞置-80℃冰箱中數(shù)分鐘，讓管中液氮控發(fā)后，再放入37℃的水

        浴鍋中(預(yù)防凍存管爆裂)，輕搖凍存管使其最好在2 min內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過凍存管管口，否則容易造成污染。

        問題三：高效進行細胞凍存應(yīng)該注意什么?

        1、緩慢冷凍：慢凍可使細胞逐步脫水，細胞不會因產(chǎn)生大的冰晶而受到損害。相反，細胞內(nèi)若出現(xiàn)大結(jié)晶會引起細胞膜、細胞器的損傷和破裂。

        2、細胞活力及濃度：細胞應(yīng)在生長良好、致密度約為80-90%活力達90%以上的狀態(tài)下凍存。細胞活力差的細胞在凍存后的成活率很小，因此，一定要在細胞旺盛分裂時期凍存。

        3、凍存密度：凍存時細胞密度少于5x105個活細胞/mL時，很難成功復(fù)蘇。

        4、凍存管蓋子：凍存管的蓋子一定要擰緊，否則水浴復(fù)蘇時水會滲入造成污 染。

        5、凍存時間：細胞不可長期保存在-80℃冰箱中。我們建議在-80℃冰箱中的保存時間不要超過48h。

        問題四：細胞凍存和復(fù)蘇的最佳時間是什么時候?

        細胞在體外生長期間，通常分為三個階段:潛伏期、指數(shù)生長期和平臺期。潛伏期通常是細胞剛剛傳代，此時細胞開始貼附基質(zhì)和伸展骨架，代謝活動集中在粘附蛋白和骨架蛋白的表達，細胞量在這段時間內(nèi)幾乎沒有增加。

        隨后，細胞開始指數(shù)生長期，核酸轉(zhuǎn)錄翻譯旺盛，DNA解旋、配對頻繁，胞內(nèi)物質(zhì)傳遞迅速，細胞數(shù)量迅速增長。如果在這個時期凍存，實際上是強行將細胞凍結(jié)在代謝的某一時刻，勢必造成對解旋的DNA、轉(zhuǎn)錄翻譯中的RNA和蛋白的機械損傷，增加某個環(huán)節(jié)發(fā)生錯誤的風險。

        有著細胞數(shù)量的增長，培養(yǎng)容器內(nèi)，細胞匯合達到90%以上。大部分細胞因為“接觸抑制”而停止高速代謝和增殖，胞內(nèi)活動趨于平緩。所以，我們建議在剛剛進入平臺期時凍存細胞，既可以獲得足量的細胞，也不會對細胞造成過多的機械損傷。

        問題五：臨床手術(shù)切下來的腫瘤組織的凍存和復(fù)蘇應(yīng)該怎么做?

        不論是腫瘤組織、正常組織或細胞的凍存和復(fù)蘇需要把握的關(guān)鍵都是“慢凍快融”。

        組織凍存中使用的“玻璃化液”和細胞凍存中使用的“凍存液”作用的本質(zhì)都是結(jié)合或吸收細胞內(nèi)的自由水，避免或減少細胞在冷凍過程中，胞內(nèi)的自由水凝結(jié)為冰晶刺破細胞。

        通常，環(huán)境溫度在-5~-10℃之間時，細胞內(nèi)開始形成冰晶?？焖俚睦鋬鰰觿”У男纬?/span>，所以，我們在凍存細胞時會使用程序降溫儀，含異內(nèi)醇的程序降溫盒或者特質(zhì)的泡沫盒。這些儀器、設(shè)備、試劑的使用都是為了減緩細胞冷凍速度。

        至于復(fù)蘇，我們一般是在37℃水浴鍋中震蕩，讓細胞、組織迅速度過“冰晶危險期”。

        問題五：細胞在液氮中可以保存多久?

        細胞凍存可以使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來，細胞儲存在液氮中，溫度達-196℃，理論上儲存時間是無限的。

        為妥善起見，特別是很多未被凍存過的細胞在首次凍存后要在短期內(nèi)復(fù)蘇1次，觀察細胞對凍存的適應(yīng)性。已建系的細胞最好也每年復(fù)蘇1次后，再繼續(xù)凍存。

        好啦，那大家常提的問題咱們就總結(jié)到這里啦，如果您還有其他的問題也可以給我們留言提出，小編會收錄到文章中跟大家一起學習進步的哦。當然有細胞實驗需要代做或細胞購買的話一定要選擇我們的普拉特澤生物——細胞實驗平臺！