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        細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的操作步驟與注意事項(xiàng)由普拉特澤生物跟大家一起詳細(xì)學(xué)習(xí)。細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一，是將細(xì)胞放在低溫環(huán)境，減少細(xì)胞代謝，以便長期儲(chǔ)存的一種技術(shù)。普拉特澤生物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)平臺(tái)提供多種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)代做與細(xì)胞質(zhì)粒購買的服務(wù)，擁有自己的的細(xì)胞庫，所有細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇是非常重要的常規(guī)操作，從未出現(xiàn)一例細(xì)胞保存相關(guān)的失誤和錯(cuò)誤。多年操作中也總結(jié)出了自己的一套細(xì)胞凍存與復(fù)蘇操作的詳細(xì)步驟與注意事項(xiàng)，今天傳授給大家，建議全文背誦~

        細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一，利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來，這樣在需要的時(shí)候再復(fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。而且適度地保存一定量的細(xì)胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種，起到了細(xì)胞保種的作用。除此之外，還可以利用細(xì)胞凍存的形式來購買、寄贈(zèng)、交換和運(yùn)送某些細(xì)胞。那現(xiàn)在我們來看看細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的操作步驟：

        一、細(xì)胞凍存的詳細(xì)操作步驟 

        1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液；

        2. 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，去除舊培養(yǎng)液，用PBS清洗。

        3. 去除PBS，加入適量胰蛋白酶（覆蓋培養(yǎng)皿表面）把單層生長的細(xì)胞消化下來；

        4. 離心1000rpm，5min；

        5. 去除胰蛋白酶，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml；

        6. 將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml；

        7. 在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間及操作者；

        8. 凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?/span>-1～-2℃/ min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。

        二、細(xì)胞復(fù)蘇的詳細(xì)操作步驟

        1. 提前打開水浴鍋，將水溫調(diào)至37℃，將需要用到的培養(yǎng)基放入水浴鍋預(yù)熱。

        2. 復(fù)蘇時(shí)，將凍存細(xì)胞放入水浴鍋中快速搖晃使細(xì)胞在1~2min內(nèi)迅速解凍。

        3. 準(zhǔn)備一只15ml離心管，加入5ml培養(yǎng)基，將解凍后的細(xì)胞懸液吸出放入到離心管內(nèi)混勻，

        蓋上蓋子，放入離心機(jī)內(nèi)，1000rpm離心5min。

        4. 離心完畢，用移液槍小心吸 去上清，加入1mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

        5. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充適量培養(yǎng)基，將細(xì)胞吹打均勻，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

        6. 這樣我們就完成了細(xì)胞的復(fù)蘇的流程，復(fù)蘇后的細(xì)胞通常在24小時(shí)內(nèi)會(huì)貼壁，第二天我們?nèi)〕黾?xì)胞便可以在顯微鏡下觀察細(xì)胞的狀態(tài)。

        三、細(xì)胞凍存與復(fù)蘇操作的注意事項(xiàng)

        1. 取細(xì)胞的過程中注意帶好防凍手套，護(hù)目鏡。此項(xiàng)尤為重要，細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時(shí)凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸。

        2. 凍存液：凍存液的配置已是常識(shí)，在這里不作詳述，但二甲基亞砜（DMSO）對(duì)細(xì)胞不是完全無毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對(duì)細(xì)胞的毒副作 較大，因此，必須在1-2min內(nèi)使凍存液完全融化。如果復(fù)蘇溫度太慢，會(huì)造成細(xì)胞的損傷。

        3. 離心前須加入少量培養(yǎng)液。細(xì)胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少對(duì)細(xì)胞的損傷。

        4. 細(xì)胞貼壁少：教科書中說明凍存細(xì)胞解凍時(shí)1ml細(xì)胞液要加10ml－15m培養(yǎng)液，而在我的試驗(yàn)中的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)為培養(yǎng)基越少細(xì)胞越容易貼附。

        6. 復(fù)蘇細(xì)胞分裝：復(fù)蘇1管細(xì)胞一般可分裝到1-2只培養(yǎng)瓶中，分裝過多，細(xì)胞濃度過低，不利于細(xì)胞的貼壁。

        7. 加培養(yǎng)基的量：加培養(yǎng)基的量主要和DMSO的濃度相關(guān)，如果加培養(yǎng)基的太少，DMSO的濃度就會(huì)比較大，會(huì)影響細(xì)胞生長。從文獻(xiàn)資料上看，DMSO的濃度在小于0.5%的時(shí)候?qū)σ话慵?xì)胞沒有影響。還有一個(gè)說法是1％，所以如果凍存液的濃度是 10％DMSO，那么加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度。

        好啦，那關(guān)于細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的詳細(xì)操作步驟與注意事項(xiàng)咱們就介紹到這里啦，如果您有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包與細(xì)胞購買的需求的話歡迎留言，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的技術(shù)會(huì)及時(shí)給到回復(fù)的哦！

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