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早期乳腺癌的癥狀多不明顯，晚期乳腺癌可發(fā)生癌細胞遠處轉移，出現全身多器官病變，直接威脅患者的生命。目前，患乳腺癌后的骨轉移是乳腺癌高死亡率的主要原因（70%占比），那是否有方法通過調節(jié)免疫特性，去減少轉移性生長呢？這篇發(fā)表于Cancer Research上的文章就為大家做了詳細的講解~

結論：

作者揭示了ERRα通過增加骨微環(huán)境的免疫活性來抑制乳腺癌細胞的骨轉移。乳腺癌骨轉移中ERRα的過表達誘導趨化因子CCL17和CCL20的表達，并抑制轉化生長因子β3（TGF-β3）的產生。隨后，募集到骨轉移的CD8 + T淋巴細胞逃脫了TGF-β信號的控制，并具有加劇的細胞毒性特征，從而大大減少了轉移。作者在小鼠中發(fā)現的臨床相關性在240多名乳腺癌患者中得到了證實。因此，這項研究表明，ERRα調節(jié)骨骼微環(huán)境中的免疫特性，有助于減少轉移性生長。

正文解讀

Fig1：在晚期乳腺癌中過表達ERRα模型抑制骨轉移發(fā)育

作者首先將4T1-CT；4T1-ERRα；4T1-CT（af2）；4T1-ERRαAF2細胞接種到BALB / c小鼠中。接種后13-15天，分析溶骨性病變。圖A~G為4T1-CT與4T1-ERRα對照組。圖H~N為4T1-CT（af2）與4T1-ERRαAF2對照組。

圖1 A：CT拍照，溶骨區(qū)用虛線劃分。

圖1 B：骨溶解顯示溶骨性病變的平均大小。

圖1 C、D：脛骨的矢狀切面(C)和橫切面(D)的三維微ct重建表示，跟隨骨沿平面的切割，在C中以虛線表示。

圖1 E：骨體積/組織顯示體積百分比。

圖1 F：三色染色后骨骼切片的組織學圖像。腫瘤用虛線和*表示骨髓。

圖1 G：腫瘤負荷/軟組織體積百分比。

結果顯示，在晚期乳腺癌中，ERRα過表達組的骨溶解減少，ERRαAF2（ERRα功能域突變）實驗組的骨溶解增加。

Fig2：晚期乳腺癌細胞中ERRα的過表達對肺轉移的發(fā)生沒有影響

圖2 A：細胞注射第15天HE染色后小鼠肺的組織學分析。轉移灶用* (B)圖表示3個不同深度的代表性切片上的肺轉移的癌細胞計數。

圖2 C-F：（C和E）壓碎來自用于定量骨轉移的同一只小鼠的肺，將釋放的細胞培養(yǎng)2周。肺轉移菌落的代表性圖片和(D和F)是說明所有小鼠形成的肺轉移菌落數量平均值的圖表。

圖2 G：顯示了2周后在肺轉移細胞集落ERRα的平均表達。半定量PCR對n=3只動物進行3個重復的PCR，并對核糖體蛋白基因L32進行歸一化。

考慮到4T1細胞也定居在肺中，作者分析了ERRα表達對LM發(fā)育的影響。結果與骨骼相反，從肺中提取的LM數量和BCa菌落數量均與4T1細胞中ERRα的表達水平無關。（A-F）但是與對照組相比，4T1-ERRα注射組中觀察到了LM中的ERRα過表達。

結合圖1、圖2的結果，揭示了乳腺癌細胞中ERRα的過度表達阻止了它們在骨骼中的生長，并提示了乳腺癌中ERRα的表達可能會影響骨骼微環(huán)境，從而阻止骨轉移進展。

Fig3：晚期乳腺癌細胞中ERRα的過表達促進CD8 + T細胞毒性作用

從接種了4T1-CT或4T1-ERRα細胞的小鼠（n = 4）的轉移腿（骨頭）（A，C，D-F）或肺（B，C）制備細胞懸液。

圖3 A-B：CD45 +造血細胞的流式細胞術等高線圖，顯示了T細胞（CD3 +），B細胞（CD19 +）和CD4 / CD8 T細胞的比例，以及代表骨骼中細胞百分比的圖（A）和肺部（B）。

圖3 C-E：流式細胞儀等高線圖說明了CD8 + T細胞中FasL（細胞凋亡因子），LAMP-1（溶酶體關聯膜蛋白），粒酶A和B（毒細胞檢測因子）以及IFN-β（腫瘤壞死生長因子）的產生。（D）圖形顯示細胞百分比，（E）顯示其絕對數。

圖3 F-G：TUNEL分析后表達骨的4T1-CT或4T1-ERRα切片的熒光顯微照片以及虛線矩形的放大圖。DAPI染色后，凋亡細胞顯示為紅色，細胞核顯示為藍色。（G，H）比例尺＝50μm，T：腫瘤，GP：具有凋亡性肥大性軟骨細胞的生長板，由白色箭頭表示。

將接種了4T1-C和4T1-ERRα細胞的小鼠的腿和肺制備細胞懸液。通過流式細胞儀檢

測B細胞、T細胞、毒性、炎癥因子、凋亡等指標的差異。結果顯示，ERRα在BCa細胞中的表達會影響T細胞在骨骼中錨定后的穩(wěn)態(tài)。與對照組相比，ERRα處理組發(fā)現明顯的細胞凋亡。

Fig4：CD8+ T細胞消耗恢復4T1-ERRα骨轉移進展

圖4 A：流式細胞術分析證實加入cd8抗體后，骨中CD8+T細胞缺失。

圖4 B：拍照顯示4T1-ERRα細胞接種18天后溶骨性病變情況。溶骨區(qū)用虛線劃分。

圖4 C-E：三維microCT重建脛骨的代表在矢狀部分(C)和橫截面(D)骨沿平面切割。(E)中的虛線所示圖表說明的意思是骨體積/組織體積。

結果表明，ERRα在BCa細胞中的表達會影響CD8 + T細胞的穩(wěn)態(tài)，并增加其在骨骼中的抗腫瘤細胞毒性程序，從而控制腫瘤的進展。

Fig5：ERRα在晚期乳腺癌細胞中上調Ccl17和Ccl20

圖5 A：細胞因子、趨化因子和生長因子mRNA在4T1- ERRα細胞和4T1-ct細胞中的表達，與Ppia、Actb和Rplp0的表達對照

圖5 B-D：為對3個重復樣本進行RT-PCR并對核糖體蛋白基因L32進行歸一化后的相關基因表達情況

圖5 E：分析了患有4T1-ERRα和4T1-CT病變的小鼠(n=3)粉碎骨骼后獲得的腫瘤細胞集落，并在4周內培養(yǎng)

圖5 F：4T1-ERRα和4T1-CT細胞定植的骨切片上Ccl17和Ccl20的免疫染色。T:腫瘤，GP:生長板。

圖5 G：流式細胞儀等高線圖顯示了CCR4和CCR6在4T1-ERRα細胞或4T1-CT細胞定植的骨CD8+T細胞上的表達。

結論：通過生信分析發(fā)現ERRα在晚期乳腺癌細胞中可上調下游Ccl17和Ccl20的表達，后續(xù)通過QPCR和免疫組化驗證。

Fig6：ERRα在晚期乳腺癌細胞中上調Ccl17和Ccl20

圖6 A：基于涉及免疫系統(tǒng)過程的蛋白質的基因本體學聯盟提取的信息覆蓋最小網絡（包含101種蛋白質），并創(chuàng)建“特定于對腫瘤的免疫應答的最小網絡”（包含52個蛋白質）

圖6 B-C：通過對串擾子的系統(tǒng)最短路徑定義，確定了ESRRA潛在的新調控因子VCAM1、MACF1、HUR和TGF-β3。

圖6 D：分析4T1-ERRα、4T1-ERRα-AF2、4T1-CT和4T1-CT(AF2)細胞

圖6 E：分析了患有4T1-ERRα或4T1-CT病變的小鼠(n = 3)粉碎骨骼后獲得的腫瘤細胞集落，并在4周內培養(yǎng)

圖6 F：Tgf-β3在4T1-ERRα；4T1-CT；4T1-CT（af2）；4T1-ERRαAF2細胞定植的骨切片上的免疫染色。

圖6 G：用反向激動劑XCT-790將4T1-ERRα細胞培養(yǎng)24小時后TGF-β表達量

圖6 H：對MCF7和B02克隆的mRNA進行RT PCR。顯示了每個MCF7克隆的三種不同培養(yǎng)物的TGF-β3平均值

圖6 I：流式顯示了4T1-ERRα細胞或4T1-CT定植的骨CD8+ T細胞中SMAD2/3的磷酸化。

基于創(chuàng)建的“特定于對腫瘤的免疫應答的最小網絡”（包含52個蛋白質），對串擾子的系統(tǒng)最短路徑定義，確定了兩個新的ESRRA（ERRα）-CCL17或ESRRA-CCL20相關的調節(jié)劑：VCAM和TGF-β 3。結果表明，ERRα的過表達抑制了BCa中TGF-β3的表達，因此可以防止BCa BM在免疫細胞中產生由TGF-信號激活提供的免疫抑制微環(huán)境。

整體結論如下：

1.ERRα在BCa細胞中的表達抑制骨轉移后的骨溶解；

2.BCa細胞ERRα的表達影響骨中的T細胞的穩(wěn)態(tài)；（募集T細胞）

3.ERRα表達導致BCa細胞中CCL17和CCL20的上調；

4.ERRα的過表達抑制了BCa中TGF-β3的表達，因此可以防止BCa BM在免疫細胞中產生由TGF-信號激活提供的免疫抑制微環(huán)境。