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今天分享的文獻題目是：Hypoxia alters the response to anti-EGFR therapy by regulating EGFR expression and downstream signaling in a DNA methylation-specific and HIF-dependent manner，影響因子為9.728分，發(fā)表在Cancer Res.雜志上，發(fā)表時間為2021年5月。

該文章主要探究了：缺氧條件下的部分乳腺癌細胞，通過DNA甲基化的作用機制，降低了HIF-1α在EGFR基因上結(jié)合位點的甲基化水平，從而促進了EGFR的表達，在這種情況下，EGFR抑制劑對乳腺癌細胞的敏感性更強。

本篇文章的研究背景是這樣的：缺氧可促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，作者的近期研究表明缺氧對一些保守基因有獨特的轉(zhuǎn)錄反應，此文獻中選擇了表皮生長因子受體(EGFR)作為研究對象；EGFR在癌癥中過表達，參與激活多條信號通路，在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著不容忽視的作用；正常情況下，EGFR的表達主要受其mRNA的調(diào)節(jié)，在膠質(zhì)瘤中也以此機制調(diào)控其表達，但在其它實體瘤中mRNA調(diào)節(jié)其表達不常見；已有文獻表明，在多種癌癥中，EGFR啟動子區(qū)域的高甲基化改變了EGFR的表達情況；然而，EGFR低甲基化是否以及如何改變基因表達，還沒有被研究過。因此，此篇文獻作者著眼于在乳腺癌細胞高表達的EGFR的作用機制的研究和探討。

接下來通過作者得到的實驗結(jié)果來分析這篇文章吧!

一、缺氧條件下，EGFR表達在部分乳腺癌細胞株中被誘導

在作者的前期工作中，對31種乳腺癌細胞株在20%或1%氧氣條件下暴露24小時進行了RNA測序分析，發(fā)現(xiàn)每株細胞株中均有1000個以上基因被誘導或抑制，但只有42個基因?qū)Φ脱跽T導起保守效應，其中就包括在部分乳腺癌細胞株高表達的EGFR。為了確認這一結(jié)果，作者在這里也通過qPCR檢測了低氧誘導后31株乳腺癌細胞株中EGFR的表達，發(fā)現(xiàn)只有7株細胞中的EGFR表達被誘導了2倍甚至更高（Fig.1A）。接下來選擇了6株管腔細胞系和5株基底細胞系來檢測EGFR表達情況，6株管腔細胞系的EGFR在缺氧條件下全部被誘導，而基底細胞系只有1株細胞被誘導（Fig.1B-D）?？紤]到管腔細胞表達雌激素受體（ER），而基底細胞不表達，推測ER可能影響了EGFR的表達。在缺氧條件下，采用4-羥基他莫昔芬(OHT)或氟哌啶醇抑制ER，或采用ER cDNA過表達ER，都未能影響EGFR的表達（補充材料）。在TCGA數(shù)據(jù)庫中得到，管腔(ER+)或基底(ER-)乳腺癌樣本患者中，EGFR表達與缺氧評分表達相關(guān)，從而排除ER對EGFR表達的影響。以上結(jié)果說明，在缺氧條件下，只有部分乳腺癌細胞株中EGFR表達被誘導，且跟ER無關(guān)。

二、缺氧條件下，EGFR表達被誘導依賴于HIF-1α

腫瘤細胞生存和適應缺氧條件，部分是通過激活缺氧誘導因子1 (HIF-1)和HIF-2，誘導參與血管生成、葡萄糖利用、侵襲和轉(zhuǎn)移的基因產(chǎn)物的表達，因此，推測HIFs可能影響了EGFR的表達。采用CRISPR技術(shù)敲除HIF-1α和HIF-2α，結(jié)果得到，缺氧條件下誘導的EGFR高表達效應被敲除HIF-1α阻斷了，而敲除HIF-2α對EGFR表達沒有影響（Fig.2A-B），說明EGFR的表達依賴于HIF-1α。接著，作者探究了EGFR下游通路的影響。在缺氧和正常氧氣條件下，EGF刺激30分鐘后AKT和ERK的磷酸化水平均增加（Fig.2C）， 在缺氧條件下，敲除HIF-1α或加入EGFR抑制劑后，阻斷了AKT和ERK的磷酸化水平（Fig.2D-E）。以上結(jié)果說明：缺氧條件下HIF-1α增加EGFR表達，激活 EGFR的下游通路。

三、EGFR基因包含一個功能性缺氧反應元件，也就是HIF-1α與EGFR的結(jié)合位點

前面的結(jié)果已經(jīng)說明HIF-1α能影響EGFR的表達，為了進一步確定HIF-1α是否是EGFR的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，作者通過文獻查找EGFR基因中公認的HIF-1α結(jié)合位點。從一項研究中使用暴露于0.5% O2或2mM DMOG的MCF-7細胞中HIF結(jié)合位點的高分辨率全基因組定位發(fā)現(xiàn)：在EGFR基因座的第18內(nèi)含子中存在一個高強度的HIF -1α結(jié)合區(qū)域（Fig.3A）。同時用ChIP實驗進一步確認了第18內(nèi)含子的結(jié)合區(qū)域，并排除了第17內(nèi)含子區(qū)域（Fig.3B），由于31株乳腺癌細胞株中只有7株在缺氧條件下顯示出EGFR顯著誘導，作者推測EGFR可能在HIF-1結(jié)合區(qū)包含一個或多個單核苷酸變異(SNV)，于是作者從10個細胞系中分離DNA, Sanger測序并擴增了含有HIF-DNA結(jié)合位點的400 bp的EGFR區(qū)域，發(fā)現(xiàn)有三株細胞的有一個共同的點突變（T >C），采用熒光素酶報告實驗檢測得到，插入的HIF結(jié)合的位點的序列以及包含EGFR的單核苷酸(T >C)突變體，在缺氧條件下熒光素酶活性顯著增強，而包含有三個HIF位點突變體對熒光素酶活性沒有影響（Fig.3C-D）。以上結(jié)果說明缺氧條件下HIF-1α特異性募集到EGFR基因的內(nèi)含子18與EGFR直接結(jié)合，單核苷酸突變未能影響兩者之間的結(jié)合，進而無法影響EGFR的表達。

四、EGFR中的HIF結(jié)合位點改變了乳腺癌細胞系的甲基化模式

上述結(jié)果說明單個核苷酸的突變并不能影響乳腺癌細胞系在缺氧條件下誘導EGFR的表達情況，考慮到啟動子區(qū)域的甲基化是基因沉默的影響因素，作者質(zhì)疑ACGTG結(jié)合位點的甲基化狀態(tài)是否在其中發(fā)揮了作用。

為了評估EFGR啟動子HIF-1α結(jié)合區(qū)的甲基化狀態(tài)，作者提取了MCF7、HCC1428、BT474、CAMA1、HTERT-HME、MCF-10A、HCC1806、BT-20、SUM159、MDA-MB-231等乳腺癌細胞的DNA，亞硫酸鹽處理后，PCR擴增了約400bp的包含HIF-DNA結(jié)合位點片段，并進行Sanger測序。測序結(jié)果（Fig.4B）顯示MCF7、HCC1428、BT474、CAMA1細胞在HIF-DNA結(jié)合區(qū)未出現(xiàn)易發(fā)生DNA甲基化的位點，而HTERT-HME、MCF-10A、HCC1806、BT-20、SUM159、MDA-MB-231細胞存在較多的可能發(fā)生DNA甲基化的ACGTG位點。同時色譜分析亦證實了上述結(jié)果（補充資料）。接下來作者用甲基化特異性PCR（MS-PCR）和高分辨率熔解曲線分析（HRM）兩種方法驗證了