Transwell檢測實驗報告【整理】
2024-02-28 11:20:51
來源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學整體課題外包平臺
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一、實驗原理
侵襲是Transwell實驗的一種，可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細胞生長、運動等的影響。將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內稱上室，培養(yǎng)板內稱下室，小室底部鋪了一層聚碳酸酯膜相隔。聚碳酸酯膜上室側鋪上一層基質膠，用以模仿體內細胞外基質，細胞欲進入下室，先要分泌基質金屬蛋白酶（MMPs）將基質膠降解，方可通過聚碳酸酯膜。通過結晶紫然后后測定細胞計數值可反映腫瘤細胞的侵襲能力。
二、實驗通用儀器及試劑
1.主要儀器
2. 主要試劑
三、實驗步驟
1. 細胞復蘇
(1) 將ddH2O預溫至37℃。
(2) 戴上手套和口罩帽子，從液氮罐中取出裝有目的細胞的凍存管（內有1 mL細胞混合液），立即投入37℃ ddH2O中，輕搖凍存管使之在1分鐘內快速溶解。
(3) 完全溶解后，75%酒精擦拭凍存管外壁消毒后帶進超凈臺。
(4) 在超凈臺中，在15 mL滅菌離心管中預先加入10 mL新鮮配制的培養(yǎng)基，打開凍存管，將所有凍融的細胞懸液加入該離心管中，常溫1000 rpm離心3分鐘，吸除上層的培養(yǎng)液。
(5) 1mL培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，輕輕吹打混勻后加入T25細胞培養(yǎng)瓶中，補足培養(yǎng)基至5 mL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
(6) 48小時后換液，細胞融合接近80%時即可傳代。
2. 細胞預處理
MDA-MB-231細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃飽和濕度、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3.細胞轉染
(1) 鋪板：處于對數生長期的細胞，胰蛋白酶消化成單細胞懸液，按實驗需要接種于6cm皿中，根據細胞大小和形狀調整接板細胞量。
(2) 培養(yǎng)：37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細胞長至50%~60%匯合度進行轉染。
(3) 質粒和脂質體準備：用500 μL的不含血清的培養(yǎng)基孵育8μg的質粒；500 μL的不含血清的培養(yǎng)基孵育16μL的 Lipo3000，靜置5 min；將含質粒和含有脂質體的培養(yǎng)基混合，混勻后室溫靜置20 min。
(4) 棄去板中原有培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基，加入混合液，4-6 h后換含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。
4.侵襲實驗
(1) 用無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質膠，小室室各加100 μL（20-30 μg/孔），放入37℃培養(yǎng)箱中待其凝固，出現“白色層”取出小室。
(2) 轉染48 h后分別消化收集各組細胞，用無血清培養(yǎng)基重懸細胞。
(3) 取出小室，加入500 μL無血清培養(yǎng)基，放入37℃培養(yǎng)箱中。
(4) 吸掉已充分浸潤基底膜后的侵襲小室內的培養(yǎng)基。
(5) 加500 μL的含有10% FBS的培養(yǎng)基至下室（侵襲小室外，24孔板孔內）；加300 μL已調節(jié)好細胞密度的細胞懸液（5×104個）至侵襲小室內；置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱48 h。
(6) 取出小室，用4%多聚甲醛固定20 min，用棉簽輕柔擦拭以去除侵襲小室內未侵過基底層膜的細胞，以及基底層（Matrixgel），小心操作以免刺穿底層聚碳酸酯膜。
(7) 在新的24孔板孔中加500 μL結晶紫，分別將侵襲小室浸入染色10 min。
(8) 用PBS沖洗掉侵襲小室上多余的染料，置于空氣中干燥。
(9) 100倍顯微鏡拍照，再用PS進行細胞計數，計算各孔的穿過去的細胞數量。
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