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  GST pulldown實驗是一種常用的蛋白質(zhì)相互作用分析方法，適用于研究兩個或多個蛋白質(zhì)之間的直接或間接相互作用關(guān)系。該方法利用融合的GST標(biāo)簽對目標(biāo)蛋白進(jìn)行親和層析分離，從而實現(xiàn)目標(biāo)蛋白和與其相互作用的蛋白的純化和鑒定。

  本文將介紹GST pulldown實驗的詳細(xì)步驟，包括蛋白表達(dá)、親和層析、洗滌、洗脫和分析等方面。

                                                   （附GST pulldollwn結(jié)構(gòu)圖）

GST標(biāo)簽蛋白的表達(dá)

  首先需要在目標(biāo)蛋白上克隆GST標(biāo)簽，以便后續(xù)實驗中使用。可以通過PCR擴(kuò)增、限制性內(nèi)切酶消化和連接、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染等方法將GST標(biāo)簽與目標(biāo)蛋白融合。融合蛋白的表達(dá)可以使用大腸桿菌等表達(dá)宿主，根據(jù)融合蛋白的大小和目的選擇合適的表達(dá)載體和表達(dá)條件。

GST融合蛋白的純化

  將GST融合蛋白表達(dá)至一定的濃度后，可進(jìn)行蛋白質(zhì)的純化。GST融合蛋白的純化可以使用GST樹脂，將蛋白質(zhì)加入含有GST樹脂的層析柱中，再使用洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫。此時，GST融合蛋白會在GST樹脂上發(fā)生親和作用，從而實現(xiàn)純化。純化的GST融合蛋白可以通過SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行檢測，檢查其純度和完整性。

靶蛋白的制備

  制備靶蛋白可以使用細(xì)胞質(zhì)提取物、重組蛋白等樣品。為了便于后續(xù)的GST pulldown實驗，需要在靶蛋白上標(biāo)記親和標(biāo)簽，例如Flag標(biāo)簽、His標(biāo)簽等。標(biāo)記的靶蛋白可以通過SDS-PAGE凝膠電泳和Western blot檢測，檢查其純度和標(biāo)記效果。

GST pulldown實驗

  將純化的GST融合蛋白加入含有靶蛋白的細(xì)胞質(zhì)提取物中，使其在一定的條件下相互作用，然后進(jìn)行親和層析分離，分離出與GST融合蛋白結(jié)合的復(fù)合物。

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