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        EMSA實(shí)驗(yàn)詳細(xì)操作步驟由普拉特澤生物旗下生物醫(yī)學(xué)科研培訓(xùn)品牌——春風(fēng)學(xué)院總結(jié)分享，快點(diǎn)學(xué)起來吧。普拉特澤生物自建3000平米生物實(shí)驗(yàn)室，專為科研人員提供真實(shí)專業(yè)的生物實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)。

        1、EMSA實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

        （1）合理的實(shí)驗(yàn)方案

        根據(jù)研究目的合理設(shè)計(jì)特異性探針實(shí)驗(yàn)組以及非特異性探針對(duì)照組，如有必要還可以添加特異性抗體組、特異性核酸競爭組等。

        （2）樣本制備

        可以選擇提取樣本的總蛋白、核蛋白或者使用純化好的目的蛋白。對(duì)樣本蛋白進(jìn)行定量，實(shí)驗(yàn)中需等量加入蛋白。

        （3）探針制備

        根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)計(jì)不同的探針并添加標(biāo)記，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商業(yè)化的抗體也可以直接購買?，F(xiàn)在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)不再使用放射性標(biāo)記，生物素使用相對(duì)較多。

        2、形成蛋白-探針復(fù)合物

        （1）在0.5 mL離心管中按順序?qū)⑾铝薪M份混勻：

        蛋白樣本（2-5μg） XμL

        poly d(I-C) 1μL

        Binding Buffer 2μL

        Nuclease-Free ddH2O XμL

        總體積 9 μl

        （2）冰浴5 min后，加入1 μ探針。（對(duì)照組加1ul對(duì)照探針）

        （3）PCR儀中室溫（20-23℃）溫育30 min。

        3、制備凝膠，電泳

        （1）制備6.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠：（注意根據(jù)試劑情況按比例調(diào)整總體積）

        5XTBE 1 mL

        30%Acrylamide/Bis 2.2 mL

        deionized,sterilewater 6.62 mL

        80%Glycerol 80 μL

        10%AP 90 μL

        TEMED 10 μL

        總體積 10 mL

        （2）按標(biāo)準(zhǔn)步驟制備凝膠。

        （3）加樣前先在預(yù)冷的0.5X TBE buffer中120V預(yù)電泳10 min，與電泳完畢后沖洗加樣孔。

        （4）混合樣本及電泳緩沖液，點(diǎn)樣電泳。

        （5）將電泳槽置于冰上或者4℃環(huán)境中，恒壓100V進(jìn)行電泳，直至緩沖液指示帶距離凝膠底部2~3 cm為止。（大約50-60 min，根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整電泳時(shí)間及電壓；電泳時(shí)間不宜過長）

        4、轉(zhuǎn)膜

        （1）在預(yù)冷的0.5XTBE中浸泡凝膠，膜，濾紙和纖維墊。

        （2）按如下順序組裝“三明治”：纖維墊，濾紙，凝膠，膜，濾紙，纖維墊。注意電極，確保凝膠位于陰極、膜位于陽極。

        （3）在預(yù)冷的0.5XTBE中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜裝置應(yīng)置于冰上或者低溫室中，恒壓60V轉(zhuǎn)膜1h。（注意根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整電壓及時(shí)間）。

        5、檢測

        （1）去除轉(zhuǎn)好的膜，放入合適的盛有緩沖液的容器中，沖洗。（注意整個(gè)檢測過程避免膜干燥）

        （2）去掉沖洗緩沖液，加入封閉液后輕微震蕩，室溫封閉20 min。

        （3）加入適量的HRP酶標(biāo)記的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP conjugate），室溫震蕩孵育45 min。（勿將酶標(biāo)記物直接加到膜上）

        （4）去掉酶聯(lián)物稀釋液，用洗滌緩沖液洗膜三次，每次室溫輕微震蕩1 0 min。

        （5）配置反應(yīng)底物，均勻加至膜上，室溫孵育5 min。（可以在加完底物后，用薄膜輕輕覆蓋在膜上，使底物均勻覆蓋，注意不要產(chǎn)生氣泡）

        （6）化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光成像（曝光時(shí)間的長短可以根據(jù)檢測方法不同而進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整）。
好啦，那關(guān)于EMSA凝膠遷移實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)操作步驟就寫到這里啦，如果您還有其他的不懂可以留言和我們的技術(shù)小姐姐交流，更深入的學(xué)習(xí)哦！下期給大家講講EMSA實(shí)驗(yàn)操作過程中的注意事項(xiàng)，下期見！